基因工程的基本操作程序
（第二课时）
一、学习目标
1.了解“转化”的含义。
2.掌握目的基因导入不同受体细胞的方法。
3.掌握检测与鉴定目的基因的各种方法及目的。
二、重点难点
重点：
1.目的基因导入受体细胞的方法。
2.检测与鉴定目的基因的方法及目的。
难点：
1.农杆菌转化法。
2.DNA分子杂交技术。
三、学习过程
（一）将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内
和
的过程。
2.将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：易感染
植物和裸子植物，对大多数
植物没有感染能力；Ti质粒的
可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
②转化过程：目的基因插入的
→农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
（2）基因枪法
基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
（3）花粉管通道法
花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
3.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：
注射技术。
（2）操作程序：目的基因表达载体
→取卵（受精卵）→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到
性动物的
内发育→具有新性状的动物。
4.将目的基因导入微生物细胞
（1）原核生物特点：
、多为
、
相对较少等。
（2）大肠杆菌最常用的转化方法是：
处理细胞→
细胞→表达载体与感受态细胞混合→
细胞吸收DNA分子。
（二）目的基因的检测与鉴定
1.检测
（1）首先要检测
，方法是采用
。
（2）其次还要检测
，方法是采用
。
（3）最后检测
，方法是从转基因生物中提取
，用相应的
进行
。
2.鉴定：进行
的鉴定。如
。
（三）思考
1.“转化”的含义是什么？
2.农杆菌转化法的原理是什么？
3.三种导入方法各自的适用生物范围是什么？
4.用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。
5.培育转基因动物时，受体细胞能否采用动物体细胞，为什么采用受精卵？
6.目的基因的检测内容和方法的比较：
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子检测
第一步
目的基因是否进入受体细胞
是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRNA
是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质
是否成功显示出杂交带
个体水平鉴定
7.什么叫DNA分子杂交技术？DNA分子杂交的原理是什么？
8.怎样检测可以知道目的基因是否发生了转录?
怎样检测可以知道目的基因是否发生了翻译？
9.鉴定棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
四、自主练习
1.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（
）
A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
2.下列哪项表述说明了目的基因表达成功（
）
A.用DNA探针检测目的基因出现杂交带
B.用DNA探针检测mRNA出现杂交带
C.用抗原—抗体杂交检测蛋白质出现杂交带
D.以上都不能说明
3.将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，应分别采用的方法是（
）
A.显微注射法
农杆菌转化法
B.基因枪法
花粉管通道法
C.农杆菌转化法
显微注射法
D.基因枪法
显微注射法
4.下列判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平检测的是（
）
A.通过观察害虫吃棉叶后是否死亡
B.检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C.检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D.检测目的基因的表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
5.基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（
）
A.结构简单，操作方便
B.繁殖速度快、多为单细胞
C.遗传物质含量少、简单
D.性状稳定，变异少
6.下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是（
）
A.常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少
B.受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C.感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D.感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液
7.下面是口蹄疫疫苗生产过程示意图，请据图回答下列问题：
（1）首先从口蹄疫病毒中提取部分合成病毒蛋白的RNA，而不是用口蹄疫病毒的全部RNA，原因是合成病毒蛋白的RNA控制合成的病毒蛋白质，具有__________________特性，又不会使动物致病。以合成病毒蛋白的RNA产生病毒蛋白的DNA，需用到的工具酶是______________________。
（2）构建基因表达载体所需要的工具酶是________________。基因表达载体除目的基因外，还应包括________________________。
（3）导入大肠杆菌前需先将大肠杆菌处理为________细胞。
（4）为检测目的基因是否导入受体细胞，常常要借助载体上________的表达，更准确的方法是利用放射性同位素标记的________作探针与基因组DNA杂交。最后还要检测目的基因是否翻译成了病毒蛋白质，利用的技术是______________。
8.科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示：
（1）进行基因工程操作的工具酶有
，将苏云金芽孢杆菌的Bt基因导入棉花细胞内，使棉花植株产生抗虫性状，引起这种新性状产生依赖于
。细菌的基因之所以能在棉花细胞内表达，产生抗性，其原因是______________________________。
（2）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是___________________________
_______，其核心步骤是________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以________给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（3）上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用的方法是________，这种导入方法较经济、有效。目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上，这需要通过检测才能知道，检测采用的最好方法是________。
（4）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用T-DNA的______________________________特点。含有Bt基因的Ti质粒导入棉花细胞是否可以稳定维持和表达其遗传特性，必须进行检测与鉴定。检测目的基因是否导入成功可以检测Bt基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的
。检测方法是
。
（5）抗虫棉的培育过程中，抗虫基因的受体细胞可以是棉花的一般体细胞，原因是
。最后检验培育的棉花是否抗虫，常用的方法是
。
参考答案
学习过程
（一）将目的基因导入受体细胞
1.维持稳定
表达
2.（1）双子叶
单子叶
T-DNA
Ti质粒的T-DNA
3.（1）显微
（2）提纯
雌
子宫
4.（1）繁殖快
单细胞
遗传物质
（2）Ca2+
感受态
感受态
（二）目的基因的检测与鉴定
1.（1）目的基因是否插入到受体细胞染色体的DNA上
DNA分子杂交技术
（2）目的基因是否转录出了mRNA
分子杂交技术
（3）目的基因是否翻译成蛋白质
蛋白质
抗体
抗原—抗体杂交
2.个体生物学水平
抗虫或抗病的接种实验
（三）1.目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。此处的“转化”与肺炎双球菌的转化实验中的“转化”的含义相同。
2.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以整合的到受体细胞的染色体DNA上。
3.农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物；基因枪法适用于单子叶植物；花粉管通道法是我国独创的一种方法，用此方法成功培育了抗虫棉。
4.需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。
5.动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。
6.目的基因的检测内容和方法的比较：
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子
检测
第一步
目的基因是否进入受体细胞
DNA分子杂交技术
是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRNA
分子杂交技术
是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
是否成功显示出杂交带
个体水平鉴定
抗病或抗虫接种实验；将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较
7.将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，以此为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已经插入染色体DNA中。
8.检测是否转录——分子杂交法，即让目的基因制成的探针与受体细胞中的mRNA进行杂交，如果出现杂交带则证明受体细胞中有目的基因转录产生的mRNA。检测是否翻译——抗原－抗体杂交法，利用了抗原与抗体特异性结合的原理，目的基因表达后的产物就是抗原。
9.用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。这种方法是为个体鉴定法，前面的三种鉴定方法相应称为分子鉴定法。
自主练习
1.D
2.C
3.D
4.A
5.B
6.D
7.（1）抗原
逆转录酶
（2）限制性核酸内切酶和DNA连接酶
启动子、终止子、标记基因
（3）感受态
（4）标记基因
病毒蛋白基因（目的基因）
抗原—抗体杂交技术
８.（1）限制酶和DNA连接酶
基因重组或重组DNA
它们共用一套遗传密码
（2）目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定
基因表达载体的构建
遗传
（3）农杆菌转化法
DNA分子杂交技术
（4）可转移至受体细胞并且整合到受体细胞的染色体DNA上
第一步
从转基因棉花细胞内提取mRNA，用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA
（5）分化的植物细胞具有全能性
用培育的棉花的叶等器官喂食害虫，观察害虫的生活情况基因工程的基本操作程序
（第一课时）
一、学习目标
1.了解程序中四个步骤的必要性。
2.解释基因文库、基因组文库、cDNA文库的区别和联系。
3.分析第一、二个步骤使用的工具和方法。
二、学习重难点
重点：构建基因表达载体的过程。
难点：
1.从基因文库中获取目的基因。
2.利用PCR技术扩增目的基因。
三、学习过程
（一）目的基因的获取
1.目的基因：主要是指符合人们需要的，编码蛋白质的
或
。
2.获取目的基因的方法：
（1）从基因文库中获取目的基因
①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多
，导入受体菌的群体中
，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
②种类
基因组文库：含有一种生物的
基因
部分基因文库：含有一种生物的
基因，如cDNA文库。
③目的基因的获取依据：
基因的
序列、基因的功能、基因在
上的位置、基因的_________产物mRNA、基因的
产物蛋白质等特性获取目的基因。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①PCR：是一项在生物体外
特定DNA片段的核酸合成技术。
②前提条件：已知目的基因的
序列，以便根据这一序列合成
。
③条件：
、
、
、
。
④过程：目的基因DNA受热形成
，这称为变性；与
结合，这称为退火或复性；然后在
的作用下进行延伸形成DNA，这称为延伸。
⑤方式：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
（3）人工合成法
基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。
（二）基因表达载体的构建──基因工程的核心
1.表达载体的组成：目的基因、
、
、标记基因等。
2.启动子：位于基因的
，它是
和结合的部位，驱动基因转录产生所需的mRNA。
3.终止子：位于基因的
，终止
。
4.标记基因：
受体细胞是否含有目的基因。
5.表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且
给下一代；同时使目的基因能够
和发挥作用。
6.不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。
（三）思考
1.基因文库、基因组文库、cDNA文库之间的关系。
2.从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA细胞内复制的不同点。
3.载体、重组载体、基因表达载体三者有何区别？
四、自主练习
1.下列属于获取目的基因的方法的是（
）
①利用mRNA反转录形成
②从基因组文库中提取
③从受体细胞中提取
④利用PCR技术
⑤利用DNA转录
⑥人工合成
A.①②③⑤
B.①②⑤⑥
C.①②③④
D.①②④⑥
2.不属于目的基因与运载体结合过程的是（
）
A.用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端
B.用同种限制酶切割目的基因，露出黏性末端
C.将切下的目的基因插入到质粒的切口处
D.将重组DNA引入到受体细胞中进行扩增
3.分辨基因工程是否成功是通过（
）
A.提取目的基因
B.基因表达载体的构建
C.目的基因导入受体细胞
D.目的基因的检测与鉴定
4.下列不属于获取目的基因的方法的是（
）
A.利用DNA连接酶复制目的基因
B.利用DNA聚合酶复制目的基因
C.从基因文库中获取目的基因
D.利用PCR技术扩增目的基因
5.哪项不是基因表达载体的组成部分（
）
A.启动子
B.终止密码
C.标记基因
D.目的基因
6.在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的（
）
①同一种限制酶切割两者；②不需同一种限制酶切割两者；③加入适量的DNA连接酶；④不需加DNA连接酶
A.①③
B.①④
C.②④
D.②③
7.科学家通过基因工程的方法培育抗虫棉时，需从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，放入棉花的细胞中与棉花基因结合起来并发挥作用，请完成下列有关问题：
（1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是______________，此工具主要存在于______________中，其特点是____________________________。
（2）苏云金芽孢杆菌中一个DNA分子上有许多基因，获得抗虫基因常用的方法是“鸟枪法”。具体做法是：用______________将苏云金芽孢杆菌的______________切成许多片段，然后将这些片段分别______________，再通过______________导入不同的受体细胞中，让它们在各个不同的受体细胞中大量______________，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把_______________分离出来。
（3）进行基因工程操作一般要经过的四个步骤是：___________；_____________；______________；______________。
8.组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：
（1）人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入________。
（2）人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的________（基因），保证T－DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于________________。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。
（3）若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是________________________________。
参考答案
学习过程
（一）1.基因
调控因子
2.（1）DNA片段
储存
所有
部分
核苷酸
染色体
转录
表达
（2）复制
核苷酸
引物
DNA模板
引物
热稳定DNA聚合酶
四种脱氧核苷酸
DNA单链
引物
热稳定DNA聚合酶
（二）1.启动子
终止子
2.首端
RNA聚合酶识别
3.尾端
转录
4.鉴别
5.可以遗传
表达
（三）1.基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库只含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库。
2.①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶；②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有热稳定性。
3.最常用的载体是质粒，是小型环状DNA分子，含有若干基因；重组载体（重组质粒）是将目的基因和载体（质粒）利用工具酶而结合在一起的产物，可以使目的基因在受体细胞稳定存在和遗传；基因表达载体是在重组载体的基础上又添加了有利于目的基因表达的启动子和终止子，从而可以实现目的基因在受体细胞的稳定存在、遗传并且表达。
自主练习
1.D
2.D
3.D
4.A
5.B
6.A
7.（1）限制酶
微生物
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点切割
（2）限制酶
DNA
与运载体结合
运载体
复制
带有目的基因的DNA片段
（3）目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
8.（1）启动子
（2）tms和tmr
目的基因（或外源DNA）准确插入
（3）在含卡那霉素的培养基能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
