人教版生物高中选修3-1.2基因工程的基本操作程序(40张PPT)

(共40张PPT)
1.2
基因工程的基本操作程序
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
一、目的基因的获取
1
目的基因主要是编码蛋白质的基因：
如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相
关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、
与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的
基因、具调控作用的因子等。
2
获取目的基因的常用方法：
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
1.
从基因文库中获取目的基因
1.
基因文库的概念:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的
群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
2.
基因文库的种类:
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
基因组DNA文库与cDNA文库
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制酶
与运载体连接导入
基因组文库
cDNA
反转录
受体菌群体
与运载体连接导入
cDNA文库
某种生物某个时期的mRNA
基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
终止子
启动子
原核
真核
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
①不编码蛋白质。
：编码蛋白质
,连续不间断
编码区
非编码区
②调控遗传信息表达,上
游的RNA聚合酶结合位点:
基因结构
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用,上游有RNA聚合
酶结合位点(启动子)。
与RNA聚合酶结合位点
基因结构
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是_____
的，边_________边_________
编码区是间隔的、
_____的，先_____后_____
相同点
都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
转录
翻译
转录
翻译
基因文库的构建方法
①
基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
重组载体
基因组文库
导入受体菌中储存
②
cDNA文库的构建-----逆转录法：
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
单链DNA
双链cDNA片段
重组载体
与载体连接
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
思考？
真核生物的基因用逆转录法得到的
cDNA与原基因相同吗？
真核细胞的cDNA的获取
编码区
非编码区
非编码区
DNA聚合酶
剪接有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
2.利用PCR技术扩增目的基因
1
概念：
PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术。
2
原理：DNA复制
原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
3
前提：
已知目的基因的一段核苷酸序列
PCR技术的操作过程
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍
一
PCR技术的操作过程
PCR技术的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA复制
PCR技术
场所
原理
条件
解旋方式
酶
特点
结果
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP
四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化解旋
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
体外复制
主要在细胞核内
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等
3.
人工合成法
在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
基因的核苷酸序列
目的基因
化学合成
推测
推测
思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？
人工合成法（真核生物）
反转录法
目的基因的信使RNA
目的基因
化学合成法
肽链氨基酸序列
信使RNA序列
基因的核苷酸序列
目的基因
合成
推测
推测
单链DNA
合成
课堂小结
目的基因的获取
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
1
目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可
以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达
和发挥作用。
2
基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子
+终止子+标记基因
表达载体
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
基因表达载体的构建过程
质粒
DNA分子
限制酶处理
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
三、将目的基因导入受体细胞
1
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞
内维持稳定和表达的过程。
2
常用的受体细胞：
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌
和动植物细胞等。
3
目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1、目的基因导入植物细胞的方法
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植
物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
三、目的基因导入受体细胞
构建基因表达载体
转入
农杆菌
植物细胞
导入
稳定维持和表达
③过程：
1、目的基因导入植物细胞的方法
（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞
①操作方法：利用压缩气体产生的动力
，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
②
钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um
。
③适用：单子叶植物
1、目的基因导入植物细胞的方法
（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞
①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞
②
特点:十分简便经济。
③例：转基因抗虫棉
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
取卵（受精卵）
显微注射
受精卵
新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌：大肠杆菌
③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞
④过程：
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态
细胞
感受态细胞
吸收DNA
表达载体
与感受态
细胞混合
小结：将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2+处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
导入过程完成后，全部受体细胞都能摄
入重组DNA分子吗？
1
真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。
2
目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？
不一定，需要检测
1、鉴定——分子水平的鉴定
转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
14N
14N
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了
目的基因
基因探针：
放射性同位素等标记的DNA分子
方法——
DNA分子杂交技术
变性
变性
1、鉴定——分子水平的鉴定
变性
方法——
分子杂交技术
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
14N
14N
1、鉴定——分子水平的鉴定
提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
2、鉴定——个体水平的鉴定
抗虫、抗病接种实验，活性比较实验
　　例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
思考？
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？