人教版高中生物选修1-5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段(39张PPT)

(共39张PPT)
专题5
DNA和蛋白质技术
课题2
多聚酶链式反应扩增DNA片断
★分子生物学研究中最强大的实验技术之一
★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程
美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis)
发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖
㈠.DNA分子的结构
C、H、O、N、P
1.元素组成：
脱氧核苷酸(dNMP)
2.基本单位:
一.基础知识
脱氧核苷酸
脱氧核苷
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
嘌呤
嘧啶
腺嘌呤（A）
鸟嘌呤（G）
胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
3.脱氧核苷酸链的形成
脱氧核苷酸链结构简图
4.DNA分子的双螺旋结构
⑴.DNA分子是由
的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则
结构。
⑵.
与
交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；
排列在链的内侧。
⑶.两条链上的碱基通过
连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与
配对，
一定同胞嘧啶配对。
双螺旋
两条反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
氢键
胸腺嘧啶
鸟嘌呤
2、时期
有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期
3、场所
细胞核（主）（线粒体、叶绿体）
4、模板
DNA母链
1、概念
由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程
㈡.DNA的复制
5、原材料
脱氧核苷酸
6、基本条件
酶、ATP、原料、模板
7、复制过程
①
DNA的解旋
亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链
②
RNA引物的合成
　　以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。
③
DNA的生成
　　以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端→3’端合成DNA。
边解旋边复制(过程）
8、复制特点
半保留复制（结果）
9、遵循原则
碱基互补配对原则
10、精确复制的原因
11、复制的意义
　　DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。
①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
总结：胞内DNA复制的基本体系
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
㈢.PCR(多聚酶链式反应）
2.DNA聚合酶特性
不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。
3.DNA聚合酶作用过程
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，
DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
1.定义：
是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
1
2
3
4
5
22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）
适温延伸
高温变性
低温复性
重复1~3步30轮
DNA双链
单链
变性（加热80-100℃
）
复性（缓慢冷却）
4.PCR原理
⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。
⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq
DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。
5.Taq
DNA聚合酶的应用
6.需要为PCR反应提供的物质
缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、
简便、重复性好、易自动化等突出。
7.PCR技术的特点：
8.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别
体内DNA的复制
PCR
模板(母链)
引物
原料:dNTP
聚合酶
反应环境
细胞内源
引物合成酶
细胞内的环境
细胞内源
细胞内源
外源加入
缓冲液
外源加入
外源加入
外源加入
⑴.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
9.细胞内复制和PCR不同点
⑵.PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
10.PCR的重要应用：
广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。
1、PCR仪
㈠.设备及用具
实质上一台能够自动调控温度的仪器。
二.PCR的实验操作
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。
1.准备
2.移液
㈡.实验操作步骤
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。
混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。
3.混合
⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。
4.离心
⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。
5.反应
循环数
变性
复性
延伸
第一次
94℃，10min
－
－
30次
94℃，30s
55℃，30s
72℃，1min
最后一次
94℃，1min
55℃，30s
72℃，1min
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.
⑴.变性（模板DNA解旋）
模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。
⑵.复性（退火）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
⑶.延伸
DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。
靶序列
靶序列
PCR
循环第一步：高温变性
靶序列
靶序列
引物
Ⅰ
引物
Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
PCR
循环第二步
：引物与靶序列退火
靶序列
靶序列
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq
DNA
聚合酶
PCR
循环第三步
：引物延伸
靶序列
靶序列
第1个PCR循环完成后
：得到两个靶序列
PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：
6.注意事项
⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
㈠.理论上DNA扩增数目的计算
三.课题成果评价
1.一条DNA，复制n次，DNA为2n
2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n
㈡.实验中DNA含量的测定
1.原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。
2.过程
⑴.稀释
2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.
⑵.对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。
取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
⑶.计算
⑷.计算
DNA含量(?g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
50：1
?g
/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
光吸收
波长／nm
260
240
220
280
0.1
0.2
比色杯
四.课题延伸
例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、
快速、
简便、重复性好、易自动化等突出特点
五.实验小结
PCR仪加热使（
）变性,
复性使引物与模板DNA（
）,延伸需将反应温度升至中温(
),在（
）的作用下,以
（
）为原料,以（
）为复制的起点,合成新链。
如此重复改变反应温度,经（
）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;
将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。
模板
互补
Taq聚合酶
四种脱氧核苷酸
引物
变性、复性和延伸
72℃
练习
(课堂检测)
1、DNA单链的________末端为3′端,
________末端为5′端,在DNA复制时,引物从模板链的___端配对结合.在___________酶的作用下,从引物的____端,使子链向下延伸.
2每次循环可以分为______________________这三个过程,对应温度分别为__________________.
磷酸基团
羟基
羟基
DNA聚合
3/
变性、复性、延伸
94℃、55
℃
、72
℃
90℃以上、50℃左右
、72
℃左右
练习巩固
1、关于PCR技术的应用，错误的一项是
A
古生物学、刑侦破案、DNA序列测定
B
诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学
C
DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘
D
诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定
2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？
3、PCR技术最突出的优点是
A
原理简单
B
原料易找
C
TaqDNA聚合酶有耐热性
D
快速、高效、灵活、易于操作
5
/
→3
/
4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是
A
反复洗涤
B
不怕外源DNA污染
C
高压灭菌
D
在—20
℃储存