人教高中生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片断 课件（27张ppt）

(共27张PPT)
课题2
多聚酶链式反应
扩增DNA片断
㈠.DNA分子的结构
C、H、O、N、P
1.元素组成：
脱氧核苷酸
2.基本单位:
一.基础知识
脱氧核苷酸
脱氧核苷
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
嘌呤
嘧啶
腺嘌呤（A）
鸟嘌呤（G）
胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
3.多脱氧核苷酸链得形成
多脱氧核苷酸链结构简图
4.DNA分子的双螺旋结构
⑴.DNA分子是由
的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则
结构。
⑵.
与
交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；
排列在链的内侧。
⑶.两条链上的碱基通过
连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与
配对，
一定同胞嘧啶配对。
双螺旋
两条反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
氢键
胸腺嘧啶
鸟嘌呤
㈡.DNA的复制
2.时期
有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。
3.场所
细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。
1.概念
由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。
4.基本条件
酶:解旋酶、DNA聚合酶
能量:ATP
原料:四种脱氧核苷酸
模板:DNA的两条链
⑴.边解旋边复制(过程）
5.复制特点
⑵.半保留复制（结果）
6.遵循原则：
碱基互补配对原则
7.精确复制的原因
8.复制的意义
DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性
⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
总结：胞内DNA复制的基本体系
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
㈢.PCR(多聚酶链式反应）
2.DNA聚合酶作用过程
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，
DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
1.定义：
是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
3.PCR原理
PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
耐高温的Taq
DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。
4.Taq
DNA聚合酶的应用
5.需要为PCR反应提供的物质
缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
靶序列
靶序列
PCR
循环第一步：
靶序列
靶序列
引物
Ⅰ
引物
Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
PCR
循环第二步
靶序列
靶序列
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq
DNA
聚合酶
PCR
循环第三步
：
靶序列
靶序列
第1个PCR循环完成后
：得到两个靶序列
体内复制
PCR技术
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开
加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶
引物
一小段RNA
一般用DNA片段
DNA聚合酶
细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）
TaqDNA聚合酶
复制特点
半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。
半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。
复制的方向
子链的5’端向
3’端延伸
子链的5’端向
3’端延伸
6.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别
1、PCR仪
㈠.设备及用具
实质上一台能够自动调控温度的仪器。
二.PCR的实验操作
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。
1.准备
2.移液
㈡.实验操作步骤
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。
混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。
3.混合
⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。
4.离心
⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。
5.反应
循环数
变性
复性
延伸
第一次
94℃，10min
－
－
30次
94℃，30s
55℃，30s
72℃，1min
最后一次
94℃，1min
55℃，30s
72℃，1min
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.
PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：
6.注意事项
⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
㈠.理论上DNA扩增数目的计算
三.课题成果评价
1.一条DNA，复制n次，DNA为2n
2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n
㈡.实验中DNA含量的测定
1.原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。
2.过程
⑴.稀释
2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.
⑵.对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。
取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
⑶.测定
⑷.计算
DNA含量(?g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
50：1
?g
/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
光吸收
波长／nm
260
240
220
280
0.1
0.2
比色杯
四.课题延伸
例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、
快速、
简便、重复性好、易自动化等突出特点
五.实验小结
PCR仪加热使（
）变性,
复性使引物与模板DNA（
）,延伸需将反应温度升至中温(
),在（
）的作用下,以
（
）为原料,以（
）为复制的起点,合成新链。
如此重复改变反应温度,经（
）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;
将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。
模板
互补
Taq聚合酶
四种脱氧核苷酸
引物
变性、复性和延伸
72℃