动物细胞的融合与单克隆抗体的制备

(共20张PPT)
1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。
一、动物细胞融合
◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。
◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。
细胞融合是正常的生命活动
两个细胞正在融合
受精作用
2、诱导融合的因素
生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)
化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.
物理法：电激融合
病毒颗粒黏 附细胞表面
细胞膜连接
细胞膜被 病毒颗粒穿通
细胞融合、形成杂种细胞
3、动物细胞融合技术的应用
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。
思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂
质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭
活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
人们获得抗体的传统方法是
将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体
这种方法的缺点是什么
效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。
运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？
能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？
B淋巴细胞在体外不能无限增殖。
二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备
思考
单克隆抗体的制备—极富创造性的方案
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。
米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。
杂交 细胞
灭活的病毒等手段
小鼠骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
经免疫的小鼠
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选
择性培养基
第二次筛选
能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
提取单克隆抗体
动物特异性免疫
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）
细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）
第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。
选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
提取单克隆抗体。
1、单抗的制备过程要点：
3）、为何要进行两次筛选？
4）、如何进行第2次筛选？
培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。
第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。
问题强化：
1）、本过程利用了哪些原理？
免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理
2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？
这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体
1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.
2、用于治疗疾病和运载药物：
主要用于癌症治疗。
生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。
3、单克隆抗体的应用
例题1：
1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。
(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”
在一起，说明细胞膜 。
(2)单克隆抗体的准确定义应为 ( )
A．一类特殊抗体 B．无性繁殖系
C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体
D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体
(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂，其遗传性状__________。
(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了
_____________ 。
具有一定的流动性
C
有丝
不变
抗体能与抗原发生特异性结合的特点
[例题2]
（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，
将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ）
A．T淋巴细胞 B．效应B淋巴细胞
C．抗体 D．记忆细胞
（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，
正确的是 (多选) （ ）
A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台
病毒或聚乙二醇诱导
B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克
隆抗体
C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不
能无限增殖
D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，
优越性明显
BCD
ACD
已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。
（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出
杂种细胞，并说原理。
方法： 。
原理：
培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞
加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖
B
体外培养
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
足够数量的细胞群
注射到
小鼠腹腔
A
C
下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案
2、该方案能达到预期效果吗？为什么？
4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。
1、该实验方案的目的是__________
3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______
5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。
制备单克隆抗体
B细胞
抗体
细胞融合
灭活病毒
双亲细胞
分泌抗体
无限增殖
原代
传代
50
例3：
1.动物细胞工程技术的基础是：（　　　　）
　A．动物细胞融合
　B．胚胎移植
　C．动物细胞培养
　D．核移植
Ｃ
课堂练习;
２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（　　）
A．结果是相同的
B．杂种细胞的形成过程基本相同
C．操作过程中酶的作用相同
D．诱导融合的手段相同
Ｂ
３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ）
①淋巴细胞　
②小鼠骨髓瘤细胞　
③B淋巴细胞自身融合细胞　
④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞　
⑤杂交瘤细胞
A． ②④ B．①③⑤　　
C． ①②③④ 　 D．②③
C