高中生物人教版选修1专题3植物的组织培养技术 课件（共54张ppt）

专题 植物的组织培养技术
3
课题 菊花的组织培养
1
1、细胞分化的概念
一、知识回顾
在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。
2、细胞分化的特点
一、知识回顾
①细胞分化发生在整个生命进程中。
②黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合成黑色素；离体培养的上皮细胞，始终保持为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。
③造血干细胞→原红细胞→早幼红细胞→
中幼红细胞→晚幼红细胞→成熟红细胞→死亡
持久性
稳定性
不可逆性
2、细胞分化的特点
一、知识回顾
不同的细胞中遗传信息的执行情况不同，
→合成的蛋白质不同→表现出的性状不同。
基因的选择性表达
2、细胞分化的特点
一、知识回顾
遗传信息的执行情况不同 = 基因的选择性表达
遗传信息 对应 基因
执行 对应 表达
情况不同 对应 选择性
（一）植物组织培养的基本过程
二、基础知识
1、概念
在无菌和人工控制条件下，将离体的植物（器官、组织、细胞）培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其脱分化产生愈伤组织再分化形成丛芽，最终形成完整的植株。
愈伤组织
胚状体
植物组织培养
1958，美国，斯图尔德
（一）植物组织培养的基本过程
二、基础知识
1、概念
________：用于离体培养的植物器官或组织片段。　
________：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。
_________：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。
__________：细胞排列疏松、无规则、高度液泡化的无定形的薄壁细胞。
外植体
脱分化
再分化
愈伤组织
（一）植物组织培养的基本过程
二、基础知识
2、过程
切取
形成层
无菌接种
诱导愈伤组织
的形成
试管苗的形成
培养室
移栽
脱分化
再分化
离体组织或细胞
植物体
脱分化
细胞分裂素≈生长素
愈伤组织
芽
根
细胞分裂素
>生长素
细胞分裂素
<生长素
再分化
植物细胞培养
不需要光
需要光
（一）植物组织培养的基本过程
2、过程
（一）植物组织培养的基本过程
3、理论基础
细胞全能性
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。
4、表达条件
离体条件
无菌操作
适宜物质的诱导和调节（植物激素）
适宜的营养物质
温度、酸碱度、光照等条件的控制
（一）植物组织培养的基本过程
5、应用
①培育无病毒植株
②大规模培养愈伤组织（提取紫草素，治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）
④基因工程中亦需用到植物组织培养的方法
（受体细胞为植物细胞）
③人工种子（解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题）
（二）影响植物组织培养的因素
1、材料的种类、年龄及保存时间长短等
2、营养
3、植物激素
4、PH、温度、光照等条件
1、植物材料的选择
---直接关系实验的成败
①不同植物的组织培养难度不同
eg：烟草和胡萝卜的组织培养较为容易
枸杞愈伤组织的芽诱导比较难
菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝
②同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。
2、营养---MS培养基
A.大量元素
B.微量元素
无机盐
N、P、K、Ca、Mg、S
B、Mn、Cu、Zn、Fe、
Mo、I、Co
Ｎ、Ｐ主要影响蛋白质、核酸的合成；
K、 Ca、Mg、S主要影响酶的活性。
C.有机物：
D.植物激素：
甘氨酸、烟酸、肌醇、
维生素、蔗糖
生长素、细胞分裂素、赤霉素等
蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质；
维生素能促进细胞分裂和诱导器官分化；
甘氨酸是蛋白质的组成成分，也是有机氮源。
2、营养---MS培养基
讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？
同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。
3、植物激素的影响
常用植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素
①生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素
②在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈加强的趋势
③激素的使用顺序、使用的量及比例影响植物细胞的发育方向
3、植物激素的影响
生长素类
2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）
吲哚乙酸（IAA） 萘乙酸（NAA）
吲哚丁酸（IBA）等。
细胞分裂素类
作用：2，4－D有利于愈伤组织的生长；
IAA、NAA、IBA有利于器官分化。
激动素（KT）、6－苄基嘌呤(6－BA)
玉米素（ZT）。
作用：促进细胞的分裂与分化，其中KT能
明显促进芽的分化而抑制根的形成。
赤霉素类
赤霉酸（GA3）等
作用：促进不定芽和幼株伸长。
3、植物激素的影响
激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：
{16D9F66E-5EB9-4882-86FB-DCBF35E3C3E4}使用顺序
实验结果
先使用生长素，
后使用细胞分裂素
有利于细胞分裂，
但不利分化
先使用细胞分裂素,后使用生长素
细胞既分裂、也分化
同时使用
分化频率高
3、植物激素的影响
激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：
使用比例
实验结果
生长素>细胞分裂素
有利于根的分化
生长素<细胞分裂素
有利于芽的分化，
抑制根的分化
生长素=细胞分裂素
进愈伤组织生长
4．温度、光照、pH的影响
温度： 大多数植物组织培养控制在23～27℃，
低于15℃时植物组织会表现生长停止；
高于35℃时对植物生长不利。
菊花的组织培养控制在18～22℃。
光照：菊花每日用日光灯照射12h。
pH：不同植物对培养基最适pH的要求不同，
大多数控制在5～6.5。
菊花的组织培养控制在5.8左右。
三、实验操作
制备MS固体培养基
外植体消毒
接种
培养
栽 培
移栽
冲洗-酒精-无菌水冲洗-氯化汞-无菌水冲洗至少三次之上
配制各种母液
配制培养基灭菌
三、实验操作
（一）制备MS固体培养基
MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备。
1、配制各种母液
①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存
②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液
③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。
三、实验操作
（一）制备MS固体培养基
2、配制培养基
①配制培养液
②调节pH
③培养基的分装
分装到锥形瓶中，
每瓶分装50ml或100ml
由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素
3、灭菌
分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
在植物组织培养的过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作？
三、实验操作
1、植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。
2、用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长,微生物产生的代谢废物会毒害培养 的对象；培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃；
因此要进行严格的无菌操作。
三、实验操作
（二）外植体消毒
1、选材
2、消毒
菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝
①流水冲洗
菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右
用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗
② 酒精处理
三、实验操作
（二）外植体消毒
1、选材
2、消毒
菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝
③消毒液处理
取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液
三、实验操作
（三）接种
1、接种前用体积分数70%酒精擦拭工作台，点燃酒精灯，所有操作在酒精灯旁边进行，每次使用器械后都要灼烧灭菌
2、将装有培养基的锥形瓶整齐的排列在酒精灯左侧，将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（0.5-1cm）
3、左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰。
4、右手用镊子夹取菊花茎段，插入培养基中，不要倒插，每瓶6-8块外植体，接种后，将封口膜重新扎好。
三、实验操作
（三）接种
三、实验操作
（三）接种
5、接种注意事项
①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种
②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。
③插入时应注意方向：形态学上端朝上，形态学下端朝下不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分
三、实验操作
（四）培养
接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒
培养温度控制在18-22℃
每日用日光灯光照12h
三、实验操作
正常苗
污染苗
三、实验操作
1、外植体带菌
2、培养基及接种器具灭菌不彻底
3、接种操作时带入
4、环境不清洁
污染途径
三、实验操作
（五）移栽
1、打开封口膜
移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在20～25℃的遮荫环境中，适应5～7d。试管苗不萎蔫，有新生长的趋势，便可移栽。
2、清洗转移
用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间
3、移栽
幼苗长壮后，移栽到土壤中
固体基质型，含水量高、
蓄水性强、透性好，适合栽培
珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩 。
蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。
三、实验操作
（六）栽培
幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花
三、实验操作
菊花的组织培养
再分化
材料性质、营养物质、
调节物质、环境条件
外植体的消毒
接种
基本原理:
细胞的全能性
基本过程:
脱分化
愈伤组织
影响因素：
操作流程：
配制MS固体培养基
培养
移栽
栽培
课题 月季的花药培养
2
（一）被子植物的花粉发育
花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞
一、基础知识
①经历时期：
四分体时期、单核期、双核期
（一）被子植物的花粉发育
一、基础知识
②花粉粒的形成
花粉母细胞
（小孢子母细胞）
减数分裂
四分体时期
（进入单核期）
单核靠边期(小孢子)
单核居中期(小孢子)
小孢子
（单核花粉粒）
有丝
分裂
花粉管细胞核
生殖细胞核
营养细胞
生殖细胞
精子
精子
（双核期）
两个精子和一个营
养核的基因型相同
（二）产生花粉植株的两条途径
（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择
接种的花药时期
①选材
②选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素
选材是否成功是花药培养成功的关键
③花药培养时期的选择
一般来说，在单核期，花药培养的成功率最高。即：单核靠边期
（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择
接种的花药时期
④其它时期选择的缺点
选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；
选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。
（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择
接种的花药时期
⑤单核期花药的挑选
为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。
⑥选择完全未开放花蕾的原因
完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒
⑦花药培养时间
月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可能提高花粉的诱导成功率
（三）影响花药培养的因素
月季花药培养时的花粉粒最好是（ ）
A、四分体时期 B、单核居中期
C、单核靠边期 D、二核或三核花粉粒
C
（三）影响花药培养的因素
2、培养基
花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同而有所变化小麦中为N6，马铃薯、月季中为MS，油菜中为B5培养基
3、其他因素
亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种的密度等对诱导成功都有一定的影响
实验操作
（一）材料的选取
1、方法
①最常用的方法有醋酸洋红法
②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
①醋酸洋红法染色机理
醋酸洋红为碱性染色剂，而花粉细胞内有染色体，染色体主要成分是DNA和蛋白质,易被碱性染料着色染成红色 。
将体积分数45％的醋酸100ml煮沸，缓缓加入1g洋红，在加热回流8h，冷却至50℃，过滤即可。
②醋酸洋红的配置
2、醋酸洋红法
③染色操作
将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1％的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。
3、焙花青—铬钒法
将无水酒精与冰醋酸按体积比为3：1的比例混匀
①卡诺氏固定液的配制方法
将5g铬明矾[K2SO4Cr2(SO4)·24H2O]加入90ml蒸馏水中，溶解后加入0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ml。
②焙花青—铬钒溶液的配制方法
③染色操作
花药应该在卡诺氏固定液中固定20min，然后取出放在载玻片上，加焙花青—铬钒溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。
实验操作
（二）材料的消毒
1、酒精处理
①花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒，立即取出。
②无菌水清洗
③无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
2、消毒液处理
① 放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2~4分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）
② 无菌水冲洗3~5次
用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
实验操作
（三）接种和培养
1、剥取花药
在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药
注意：
①勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织
②要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成
2、接种
立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。
实验操作
（三）接种和培养
3、培养
①培养条件：温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。
②培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体
长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株
③注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
实验操作
（三）接种和培养
4、鉴定和筛选
在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养核和生殖核融合造成的）
5、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点：
项目
相同点
不同点
植物组织培养技术
离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。
外植体为体细胞，
染色体数无需加倍。
花药培养技术
取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。