课时素养评价
五 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(30分钟 100分)
一、选择题(共4小题,每小题6分,共24分)
1.下列关于能分解尿素的细菌的说法,正确的是
( )
A.能分解尿素的原因是能合成蛋白酶
B.分离该种细菌时要以尿素作为唯一碳源
C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红
【解析】选D。酶具有专一性,分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为能合成、分泌脲酶,A项错误;分离能分解尿素的细菌时要以尿素作为唯一氮源,B项错误;环境中含有大量的尿素对分解尿素的细菌起了选择作用,而非诱导作用,C项错误;该菌合成的脲酶将尿素分解为氨后,使pH升高,可使酚红指示剂变红,但添加酸碱缓冲剂后,阻止了pH的升高,因此不使酚红指示剂变红,D项正确。
2.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应,用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上划3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触),将平板置于37
℃条件下恒温培养3天,结果如图所示。从实验结果分析,以下叙述不正确的是
( )
A.链霉素能阻止结核杆菌的生长
B.链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效
C.链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效
D.链霉素可以用于治疗伤寒病人
【解析】选D。从图中可以看出,这是含有链霉素的选择培养基,接种的三种细菌中,霍乱菌和结核杆菌都可以被杀灭,并且链霉素对结核杆菌杀灭的有效程度大于对霍乱菌的有效程度,而伤寒菌的生长不受影响,所以D项错误。
3.三个培养皿中分别加入10
mL不同的培养基,然后接种相同的大肠杆菌样液,培养36
h后,计算菌落数,结果如表,下列选项正确的是
( )
培养皿
培养基成分
菌落数/个
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A.该实验采用的是液体培养基
B.该实验采用平板划线法接种
C.Ⅰ和Ⅲ对照,说明大肠杆菌的生长不需要生长因子
D.Ⅱ和Ⅲ对照,说明大肠杆菌的生长需要碳源
【解析】选D。该培养基加入了琼脂,故为固体培养基,A项错误;对微生物进行计数,应采用稀释涂布平板法接种,B项错误;Ⅰ与Ⅲ对照,有两个变量,不能证明是否需要生长因子,C项错误;Ⅱ和Ⅲ对照,自变量是有无葡萄糖,说明大肠杆菌的生长需要碳源(葡萄糖),D项正确。
4.分离土壤中分解尿素的细菌,对培养基的要求是
( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂
④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖
⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A.①③⑤⑦
B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧
D.①④⑥⑦
【解题关键】解答本题需要明确两点:
(1)尿素、琼脂、葡萄糖和硝酸盐在微生物培养中所起的作用。
(2)分离土壤中分解尿素的细菌的培养基的特点。
【解析】选C。尿素和硝酸盐都能作为氮源,而培养尿素分解菌的培养基应是以尿素为唯一氮源的固体培养基。因此培养基中应不加硝酸盐,加入尿素和琼脂。葡萄糖作为碳源,也需要加入。
【补偿训练】
平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法,下列描述正确的是
( )
A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作
C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D.都会在培养基表面形成单个的菌落
【解析】选D。平板划线法不需要进行梯度稀释,稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液滴加并涂布到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落。
二、非选择题(共5小题,共76分)
5.(11分)为更好地解决冬季污水处理厂氨氮去除率低的问题,某研究小组进行了低温下高效硝化细菌培养的研究。硝化细菌基本培养基的主要成分如下表:
(NH4)2SO4
MgSO4
KCl
NaHCO3
FeSO4
MnSO4
H2O
1.42g
0.021g
0.22g
2.40g
0.073g
0.075g
1
000mL
(1)硝化细菌能够利用__________的反应中所释放的化学能,将二氧化碳和水合成为糖类,这种合成作用叫____________________。?
(2)硝化细菌基本培养基的成分中,提供氮源的物质是______________,既能提供碳源又能够调节pH的物质是__________。该培养基与培养大肠杆菌的培养基相比,营养成分上最显著的区别是__________________。?
(3)为了分离到氨氮去除率高的硝化细菌,用于筛选时的培养基成分需要调整,即__________;同时,要注意控制________、__________和pH等培养条件。?
(4)为了观察硝化细菌菌落的大小、隆起程度、__________等菌落特征,可用稀释涂布平板法在固体培养基表面获得单个菌落,进行涂布平板操作前,要对涂布器进行灭菌,一般做法是先将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,然后_________
________________________________________。?
【解析】(1)硝化细菌能够利用氨氧化成硝酸(氨氧化成亚硝酸,进而氧化成硝酸)的反应中所释放的化学能,将二氧化碳和水合成为糖类,这种合成作用叫化能合成作用。
(2)硝化细菌基本培养基的成分中,提供氮源的物质是(NH4)2SO4,既能提供碳源又能够调节pH的物质是NaHCO3。硝化细菌为自养型生物,其培养基与培养大肠杆菌(异养型)的培养基相比,营养成分上最显著的区别是不需要提供有机物。
(3)根据题意:为了分离到氨氮去除率高的硝化细菌,用于筛选时的培养基成分需要调整,即适当提高(NH4)2SO4的浓度;同时,培养基培养微生物时都要注意控制温度、溶氧量和pH等培养条件。
(4)为了观察硝化细菌菌落的大小、隆起程度、形状等菌落特征,可用稀释涂布平板法在固体培养基表面获得单个菌落,进行涂布平板操作前,要对涂布器进行灭菌,一般做法是先将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
答案:(1)氨氧化成硝酸(氨氧化成亚硝酸,进而氧化成硝酸) 化能合成作用
(2)(NH4)2SO4 NaHCO3 不需要提供有机物
(3)适当提高(NH4)2SO4的浓度 温度 溶氧量
(4)形状 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃
6.(14分)如表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方,请根据表格和所学知识回答下列相关问题:
成分
含量
蛋白胨
10.0
g
乳糖
5.0
g
蔗糖
5.0
g
K2HPO4
2.0
g
显色剂(伊红美蓝)
0.2
g
琼脂
12.0
g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1
000
mL
(1)大肠杆菌的同化类型为____________,从生态系统的成分上看,大肠杆菌属于____________。?
(2)在微生物的实验室培养中,获得纯净培养物的关键是____________,因此需对培养基和培养皿进行____________(填“消毒”或“灭菌”),操作者的双手需要进行清洗和____________。空气中的细菌可用紫外线杀灭,其原因是紫外线能使____________,还能破坏DNA的结构。?
(3)根据用途划分,该培养基属于____________(填“选择”或“鉴别”)培养基,若要分离能分解尿素的细菌,需将培养基中____________换成____________,若要鉴定分解尿素的细菌还需将伊红美蓝换成____________。?
(4)培养大肠杆菌时,常用的接种方法是____________和____________。通过上述方法可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,称为____________。?
(5)使用以下微生物发酵生产特定产物时,所利用的主要微生物的细胞结构与大肠杆菌相同的是______(多选)。?
A.制作果酒
B.由果酒制作果醋
C.制作泡菜
D.制作腐乳
【解析】(1)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源,因此其同化作用类型是异养型;大肠杆菌在生态系统的成分中充当分解者。
(2)微生物培养时,关键是防止外来杂菌的入侵;对于培养基和培养皿需要进行灭菌处理,操作者的双手需要消毒处理;空气中的细菌可用紫外线杀灭,其原因是紫外线能使蛋白质变性,同时还能破坏DNA的结构。
(3)培养基配方中的伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂,因此,从用途上划分,该培养基属于鉴别培养基;若要分离能分解尿素的细菌,则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源,即将蛋白胨换成尿素;鉴定分解尿素的细菌,需要使用酚红指示剂。
(4)微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法;由一个细菌繁殖产生的子细胞群体,称为菌落。
(5)制作果酒利用的微生物是酵母菌;由果酒制作果醋利用的微生物是醋酸菌;制作泡菜利用的微生物是乳酸菌;制作腐乳利用的主要微生物是毛霉。酵母菌和毛霉属于真核生物,醋酸菌、乳酸菌和大肠杆菌都属于原核生物。
答案:(1)异养型 分解者
(2)防止外来杂菌的入侵 灭菌 消毒
蛋白质变性
(3)鉴别 蛋白胨 尿素 酚红指示剂
(4)平板划线法 稀释涂布平板法 菌落
(5)B、C
7.(13分)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程,图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以____________为唯一氮源;鉴别培养基还需添加____________作指示剂,产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后,其菌落周围的指示剂将变成______色。?
(2)在5个细菌培养基平板上,均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1
mL,培养一段时间后,平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是__________,每克土壤样品中的细菌数量为________×108个;与血细胞计数板相比,此计数方法测得的细菌数目较____________。?
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活,突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示的位置增加了70个核苷酸,使图乙序列出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中,终止密码为____________,突变基因表达的蛋白含__________个氨基酸。?
【解题关键】(1)关键信息:“筛选产脲酶细菌”“接种稀释倍数为105的土壤样品溶液”,“使图乙序列出现终止密码”。
(2)解题关键:区别选择培养基与鉴别培养基,掌握细菌计数的方法。
【解析】本题考查微生物的培养与分离方法及基因表达。
(1)脲酶能够催化尿素分解为氨,要从土壤中筛选出产脲酶的细菌,需用以尿素作为唯一氮源的选择培养基。由于尿素被分解成了氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高,使酚红指示剂变红色。
(2)将稀释倍数为105的土壤样品溶液接种在细菌培养基平板上,用于计数细菌菌落数的方法是稀释涂布平板法。统计的菌落数应介于30～300,选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数,每克土壤样品中细菌数量为(156+178+191)÷3÷0.1×105=1.75×108。由于两个或多个细菌连接在一起时,往往统计的是一个菌落,用此方法测得的细菌数目偏低。
(3)密码子由3个相邻的碱基组成,箭头前面的碱基一共构成91个密码子;插入的70个核苷酸和后面2个碱基一共构成24个密码子,后面是UGA,是终止密码,翻译结束后,表达的蛋白质含有115个氨基酸。
答案:(1)尿素 酚红 红
(2)稀释涂布平板法 1.75 少
(3)UGA 115
8.（18分）2020年新型冠状病毒在世界内迅速传播，我国在疫情防控期间各地均采取了多种预防措施。某公司在防疫期间推出一款新型免洗洗手凝胶。为衡量该凝胶的清洗效果，研究人员检测了凝胶洗手前后手部细菌的含量。凝胶洗手前的检测流程如图所示。回答下列问题：
（1）在进行实验前需要配制培养基，培养基指的是_____________。各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源、___________。如果培养乳酸杆菌，还需要在培养基中添加___________。
（2）为统计洗手前手部细菌的数量，应选择的接种方法是___________（填“稀释涂布平板法”或“平板划线法”）。
（3）根据上图所示的步骤得出的实验结果可信度降低，为了提高实验结果的可信度，请给出两点建议：_________________________________________。
（4）培养一段时间后可根据______________________（至少填两项）等菌落特征初步判断培养基上菌种的类型。为了计算洗手前手部单位面积的细菌数量，除上图所给的信息外，还需要知道_________________________________。
【解析】本题考查微生物的培养及计数方法。
（1）本题考查了培养基的定义和营养成分。培养基是指人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。一般培养基中均含有碳源、氮源、水和无机盐，在培养乳酸杆菌时还需要额外添加维生素。
（2）平板划线法无法得知稀释倍数，因此不能用于活菌计数。
（3）实验设计需要遵循对照原则和平行重复原则，因此需要的改进措施有：①同一稀释度下涂布三个平板，取三个平板上菌落数的平均值；②设置一组未接种的空白培养基，排除杂菌污染对实验结果造成的干扰。
（4）菌落的特征包含菌落的大小、形状、颜色和隆起程度。洗手前手部单位面积的细菌数量=（平板上的菌落数÷涂布时取样的体积×稀释倍数×10
mL）÷取样的面积。因此，除题图中所给信息外，还需要知道稀释倍数和涂布平板时所取的稀释液体积。
答案：（1）人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质无机盐维生素
（2）稀释涂布平板法
（3）①同一稀释度下涂布三个平板，取三个平板上菌落数的平均值；②设置一组未接种的空白培养基，排除杂菌污染对实验结果造成的干扰
（4）菌落的大小、形状（隆起程度和颜色）稀释倍数和涂布平板时所取的稀释液体积
9.(20分)(2019·全国Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解,会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基:在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5
g/L)。
Ⅱ号培养基:氯化钠(5
g/L),硝酸铵(3
g/L),其他无机盐(适量),X(15
g/L)。
Ⅲ号培养基:氯化钠(5
g/L),硝酸铵(3
g/L),其他无机盐(适量),X(45
g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中,为微生物提供氮源的是______________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是__________。?
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中,培养一段时间后,不能降解X的细菌比例会______________,其原因是____________________________________
___________。?
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基,若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数,接种时,应采用的方法是______________。?
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌,且该菌能将X代谢为丙酮酸,则在有氧条件下,丙酮酸可为该菌的生长提供______________和______________。?
【解析】本题考查微生物的培养与应用的相关知识。
(1)氮源是微生物生长需要的一类营养物质,是含氮化合物,可为微生物的生长提供氮元素,牛肉膏、蛋白胨来源于动物原料,含有糖、维生素和有机氮等营养物质,因此在Ⅰ号培养基中,可为微生物提供氮源的是牛肉膏、蛋白胨。碳源也是微生物生长所需要的一类营养物质,可为微生物的生长提供碳元素,而有机物均含碳元素,Ⅱ、Ⅲ号培养基均含有有机物X,因此,Ⅱ、Ⅲ号培养基为微生物的生长提供碳源的均为有机物X。
(2)由于Ⅱ号培养基含有的碳源只有有机物X,所以若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中,培养一段时间后,不能降解X的细菌由于无法获得碳源而无法增殖导致比例下降。
(3)微生物的接种方法很多,最常用的有平板划线法与稀释涂布平板法,由于稀释涂布平板法中,稀释度足够高的菌液经涂布培养后,在培养基表面形成的一个菌落是由菌液中的一个活菌繁殖而来,所以常用来进行微生物的计数。
(4)丙酮酸参与有氧呼吸的第二阶段,能被分解产生能量,且丙酮酸可作为许多物质合成的中间产物,所以它可为微生物的生长提供能量和合成其他物质的原料。
答案:(1)牛肉膏、蛋白胨 X (2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖,而能降解X的细菌能够增殖 (3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料(共39张PPT)
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、筛选菌株
1.自然界中目的菌株筛选的依据:根据它对_________的要求,到相应的环境中
去寻找。
2.实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利于_________生长的条件(包括营
养、温度、pH等),同时_____或_____其他微生物生长。
3.筛选分解尿素的细菌:在选择培养基的配方中,把尿素作为培养基中的唯一
_____,原则上只有能够利用_____的微生物才能够生长。
必备知识·自主学习
生存环境
目的菌株
抑制
阻止
氮源
尿素
二、统计菌落数目
1.常用方法:_________法。
2.统计依据:当样品的_______足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样
品稀释液中的一个_____。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含
有多少活菌。
3.计算公式:每克样品中的菌株数=(C÷V)×M,其中C代表某一稀释度下平板上
生长的___________,V代表涂布平板时所用的_____________,M代表_________。
活菌计数
稀释度
活菌
平均菌落数
稀释液的体积
稀释倍数
4.实验设计流程:
(1)土壤取样:选择富含_______,pH接近_____,且潮湿的环境。
(2)样品的稀释:
①稀释原因:样品的稀释程度直接影响平板上生长的_________。
②稀释标准:选用一定稀释范围的样品液进行培养,保证能获得菌落数在
________之间的平板,便于计数。
有机质
中性
菌落数目
30～300
③稀释倍数
a.测定土壤中细菌的数量,一般选用104,105和106倍的稀释液进行平板培养。
b.测定放线菌的数量,一般选用_____________倍稀释。
c.测定真菌的数量,一般选用_____________倍稀释。
103、104和105
102、103和104
(3)培养与观察:
①培养:不同种类的微生物,往往需要不同的培养_____和培养_____,培养细菌
的温度一般为_______℃,培养时间为1～2
d。
②观察:每隔24
h统计一次菌落数目,最后选取_____________时的记录作为结
果。
(4)计数:当菌落数目稳定时,取同一_______下的3个平板进行计数,求出_______,
并根据所对应的_______计算出样品中细菌的数目。
温度
时间
30～37
菌落数目稳定
稀释度
平均值
稀释度
三、设置对照
1.对照实验:是指除了___________以外,其他条件都相同的实验。
2.主要目的:排除实验组中
___________对实验结果的影响,提高实验结果的
_______。例如,为了确认培养基是否被杂菌污染,需以不进行接种的培养基培
养作为空白对照。
被测试条件
非测试因素
可信度
四、操作提示
1.无菌操作:
(1)取土样的用具在使用前都需要_____。
(2)实验操作均应在_______进行。
2.做好标记:本实验使用的平板和试管比较多,为避免混淆,使用前应标明培养
基的_____、_________以及平板上培养样品的_______等。
3.制定计划:对于耗时较长的生物实验,要事先制定计划,以便提高_________。
灭菌
火焰旁
种类
培养日期
稀释度
工作效率
4.菌种鉴定:
(1)检测试剂:在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_____指示剂培养分解尿素
的细菌。
(2)检测原理:
酚红
【易错辨析】
1.用平板划线法培养计数,应选择有10～100菌落数的平板。
(
)
分析:微生物计数采用稀释涂布平板法,为保证结果准确,应选择有30～300菌
落数的平板。
2.分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基。
(
)
分析:菌落只能在固体培养基上形成。
×
√
3.分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的pH降低。
(
)
分析:尿素分解菌将尿素转化为氨,使培养基的pH升高。
×
关键能力·合作学习
一、筛选菌株——选择培养基
1.目的:从众多的微生物中分离所需要的微生物。
2.筛选方法的特点及举例:
方 法
特 点
举 例
一
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养
通过控制培养基的营养成分,使营养缺陷型微生物不能正常生长
缺乏氮源时可以分离固氮微生物
方 法
特 点
举 例
二
利用某种化学物质进行的选择培养
在完全培养基中加入某些化学物质,利用加入的化学物质对微生物产生的影响,抑制某些微生物,同时选择所需的微生物
加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
三
利用培养条件进行的选择培养
改变微生物的培养条件
将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
【典题通关】
在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌;在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长;在培养基中加入10%NaCl溶液。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出
( )
A.金黄色葡萄球菌、硝化细菌、放线菌
B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C.霉菌、固氮细菌、金黄色葡萄球菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
【解题关键】解答本题需要明确两点:
(1)选择培养基的作用。
(2)不同微生物适应的环境。
【解析】选C。青霉素可以抑制细菌和放线菌,在添加青霉素的选择培养基上可以筛选分离真菌;在缺乏氮源的培养基上可以筛选分离固氮微生物;加入10%NaCl溶液的培养基可以筛选分离金黄色葡萄球菌,C项正确。
【误区警示】(1)易忽略霉菌不受青霉素的抑制,霉菌是真菌,抗生素抑制细菌。
(2)不知道金黄色葡萄球菌能耐盐,该菌有高度耐盐性,可在10%～15%的NaCl肉汤中生长。
【跟踪小练】
人和哺乳动物的尿中含有尿素,大量尿素的存在会对环境造成污染。土壤中有些细菌含有脲酶,可通过降解尿素作为其生长的氮源。现对土壤中这类细菌进行分离实验,请回答下列问题:
(1)分离培养细菌时必须进行无菌操作,培养基和各种器皿都必须是无菌的,常用的灭菌方法有____________________(至少答2种)。?
(2)将样液进行一系列的梯度稀释,然后接种培养。在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在________________旁进行操作。接种后的培养皿________于37
℃的____________中培养。?
(3)用含有酚红指示剂的培养基筛选能分泌脲酶的细菌,从功能上划分该培养基属于________培养基。若培养基中存在能分解尿素的细菌,其菌落周围会出现红色环带,这是由于尿素被分解产生的________使pH升高,酚红指示剂产生颜色变化,证明了这一菌株可以以尿素为氮源。变色区域越大,表明该菌株利用尿素的能力________。?
(4)与完全营养培养基中的菌落相比,以尿素为氮源的培养基中菌落数________。?
A.多 B.少 C.相等 D.几乎为零
【解析】(1)常用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法。
(2)在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在酒精灯火焰旁进行操作,避免周围环
境中微生物的污染。接种后的培养皿倒置培养,能够防止凝结在皿盖上的水蒸
气流到培养基表面导致污染。37
℃恒温有利于菌种生长。
(3)含有酚红指示剂的培养基能筛选分泌脲酶的细菌,为鉴别培养基。分解尿素
的细菌能够将尿素分解产生氨,使pH升高,酚红指示剂变红色。变色区域越大,
表明生成的氨越多,该菌株利用尿素的能力越强。
(4)其他微生物在培养时一般以蛋白胨为氮源,不能在以尿素为氮源的培养基上
生存,故与完全营养培养基中的菌落相比,以尿素为氮源的培养基中菌落数较少。
答案:(1)高压蒸汽灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法(至少答2种) (2)酒精灯火焰 倒置 恒温培养箱
(3)鉴别 氨 越强 (4)B
二、微生物的计数、结果分析及菌种鉴定
1.微生物的计数:常用的微生物的计数方法有直接计数法和间接计数法(稀释涂布平板法、活菌计数法)。
二者比较如下:
内 容
直接计数法
间接计数法
主要用具
显微镜、血细胞计数板
涂布器
计数依据
细菌个数
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
内 容
直接计数法
间接计数法
缺点
不能区分死菌与活菌
操作较复杂,且有一定
误差
计算公式
每毫升原液含菌株数=400×
1
000
×每小格平均菌株数
×稀释倍数①
注:①400、1
000是常数。
2.实验结果分析:
内 容
现 象
结 论
有无杂
菌污染
的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样,菌落数偏高
培养基中混入其他杂菌
选择培养
基的筛选
作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
内 容
现 象
结 论
样品的
稀释操作
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的
结果
若选取同一种土样,统计结果应接近
3.菌种的进一步鉴定:
(1)原因:分离分解尿素的细菌的选择培养基上可能生长着以分解尿素的细菌的
代谢产物为氮源的其他微生物。
(2)原理:CO(NH2)2+H2O
CO2+2NH3
由于NH3的产生,培养基的碱性增强,pH升高,因此可通过检测培养基pH的变化来
判断该化学反应是否发生。
(3)方法:在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后,若pH升高,指示剂将变红。这样,我们就可以初步鉴定该种细菌能分解尿素。
易错提醒:稀释涂布平板法计数微生物的四点提醒
(1)稀释涂布平板法选择合适的浓度涂布多个平板,选择能长出30～300个菌落的平板。
(2)在设计实验时,一定要涂布至少3个平板作为重复组。
(3)在分析结果时,一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致,如果差别过大,则意味着操作有误,需要重新实验。
(4)原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长,但实际上,微生物的培养是一个非常复杂的过程,有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖,因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物,还需进一步鉴定。
【典题通关】
下面是探究如何从土壤中分离出自生固氮菌与计数的实验,完成下列问题。
实验原理:农田的表层土壤中自生固氮菌的数量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆,接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下,只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法,可以将自生固氮菌与其他细菌分离。
材料用具:农田的表层土壤、配制无氮培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的材料、盛有9
mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90
mL无菌水的锥形瓶、恒温箱等。
(1)方法步骤。
①培养基的制备:分别配制无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基,倒平板应在__________________________操作。?
②制备土壤稀释液:取土样10
g加入盛有90
mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1
mL,转至盛有9
mL
无菌水的试管中,依次稀释到107稀释度。
③涂布平板操作:按照由107
～103
稀释度的顺序分别吸取
0.1
mL
进行涂布平板操作,每个稀释度下,无氮培养基应至少涂布________个平板,牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个。?
④培养:放入恒温箱内,在28～30
℃下培养3～4
d。
⑤计数:当菌落数目稳定时,选取菌落数在____________的平板进行计数。如果在稀释倍数为105的平板上测定的平均值为50,则每克样品中的菌体数是____________。?
(2)预期结果:相同稀释度下,牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数____________(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是_________________
_____________________________________________________________。?
【解题关键】需要考虑以下四点:
(1)实验操作中应如何落实无菌技术。
(2)无氮培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的作用。
(3)确定涂布平板的个数要符合平行重复原则。
(4)如何根据计数的结果计算菌体数。
【解析】(1)在酒精灯火焰旁倒平板,可以减少杂菌污染。为了保证结果准确,一般每个稀释度下设置3个或3个以上平板,选择菌落数在30～300的平板进行计数,并取平均值,则每克样品中的菌体数为(50÷0.1)×105=5×107(个)。
(2)可用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组来说明无氮培养基的选择作用,牛肉膏蛋白胨培养基适合其他细菌生存,所以它比无氮培养基上的菌落数目多。
答案:(1)①酒精灯火焰附近 ③3 1 ⑤30～300 5×107
(2)多于 无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌能生长繁殖,而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有微生物生长
【误区警示】(1)注意无菌操作。
(2)不明白重复实验的意义,重复实验是为了减少误差。
【方法规律】用稀释涂布平板法计数微生物的方法
(1)稀释涂布平板操作要求:按照平行重复原则每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
(2)计数的时机:当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
(3)选择可用于计数的平板:选择菌落数在30～300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数,然后取平均值。
【跟踪小练】
用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是
( )
A.平板上的一个菌落就是一个细菌
B.菌落中的细菌数是固定的
C.此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D.此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同
【解析】选C。一个菌落含有多个细菌,A项错误;一个菌落中的细菌数不是固定的,B项错误;用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌,但偶尔也来自两个或多个活菌,所以此方法统计的菌落数可能与活菌的实际数不相同,C项正确,D项错误。
