【新教材】 2020-2021学年人教版（2019）高二生物选择性必修三1.2.4 微生物的培养技术及应用 课件（22张ppt）

微生物的培养技术及应用
第二节
微生物的选择培养和计数（二）
（一）微生物的数量测定
稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
1.原理：
间接计数法 — 稀释涂布平板法
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
2.计数原则
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
3、计算：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109
C. 234 D. 23.4
B
例题1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
例题2：
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
例题3：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
直接计数 —计数板计数法
探究-实践
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
尿素的立体结构
课题目的
1、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
研究思路
土壤取样
制备培养基
样品稀释与取样涂布
微生物的培养与观察
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
琼脂
15.0g
蒸馏水
1000ml
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
1.培养基的制备
　　对照作用
　　为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2.土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
1）取样的位置：
土壤含有大量的微生物，，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近
中性的 潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3?8cm的土壤层。
2）取样要求：
先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.样品的稀释
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4.微生物的培养与观察
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
①实验组：3组接种的选择培养基?用以分离并计数能分解尿素的细菌
第4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基?用以判断选择培养基是否具有选择作用
②对照组：第5组不涂布稀释液的选择培养基?用以验证培养基中是否含有杂菌
第6组牛肉膏蛋白胨培养基?用以验证培养基中是否含有杂菌
③实验结果：前3组实验组分离得到单菌落；
第4组得到多种菌落；
第5,6组正常情况下无菌落。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
注意事项
①无菌操作
②做好标记
③规划时间
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
如
在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
操作提示
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
④不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
空白对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
（二）样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
结果分析与评价
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（三）在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因。
原因：（1）土样不同（2）培养基污染或操作失误
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？

不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
思考：
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
pH升高，酚红指示剂变红
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
脲酶阴性
脲酶阳性
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
选择培养基
特殊成分
加入某种化学物质
目的
抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长
用途
举例
鉴别培养基
加入某种指示剂
发生特定颜色反应
分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
用尿素作唯一氮源的培养基来筛选尿素分解菌
伊红—美蓝培养基
鉴定大肠杆菌
选择培养基和鉴别培养基

到社会中去
1、空气中微生物总数的检测
2、水中细菌总数的检测
3、牛奶中细菌的分离与计数
4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数
课堂总结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计