(共20张PPT)
课题2
土壤中分解尿素的细菌的
分离与计数
一、课题背景
CO(NH2)
脲酶
+ CO2
NH3
+ H2O
两个主要目的：
① 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
② 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
二、研究思路
（一）筛选菌株
（二）统计菌落数目
（三）设置对照
（一）、如何筛选目的菌株
2、实验室中微生物的筛选原理？
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
1、选择培养基：
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
15.0g
琼脂
1.0g
尿素
10.0g
葡萄糖
0.2g
MgSO4`7H2O
2.1g
NaH2PO4
1.4g
KH2PO4
3、本课题所需培养基
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
③该培养基能选择分解尿素的细菌吗？为什么？
该培养基以尿素作为唯一的氮源，只有能分解尿素的细菌才能生长，其他细菌因缺乏氮源而不能生长
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
（二）、统计菌落数目
不能区分死菌与活菌；
缺点
（二）统计菌落数目：
2、平板活菌计数法（稀释涂布平板）
（1）操作方法：
稀释涂布平板→统计菌落数
（2）原理：
1个菌落→1个活菌
（3）统计原则
①选 30 300 个菌落的平板统计
②每个稀释度取3个平板取其平均值，计算出菌落平均数统计的菌落往往比活菌的实际数目低
在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个细菌繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个活菌
2. 平板活菌计数法
① 原理：
(稀释涂布平板法)
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同
一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为
106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
计算公式：
每克样品中的菌株数 =（C÷V）×M
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得
平板上菌落数的平均数为234，那么每克样
品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液
的体积为0.1ml） ( )
A. 2.34×108
B. 2.34×109
C. 234
D. 23.4
B
怎样证明此培养基具有选择性呢？
以尿素为
唯一氮源
的培养基
牛肉膏
蛋白胨
培养基
是
分离
尿素
细菌
判断该
培养基
有无选
择性
实验组
对照组
培养基类型
是否
接种
目的
结果
只生长尿素细菌
生长多种微生物
是
（三）设置对照
三、实验的具体操作
土壤取样
制备培养基
样品稀释
取样涂布
培养与观察
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
实验时要对培养皿作好标记：注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物
在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
分离不同的微生物采用不同的稀释度
（一）土壤取样
（1）取样的位置：
土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中70 90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3 8cm处中分布着绝大多数的细菌。
（2）取样要求：铲去表层土。
（二）样品稀释
（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液
（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液
（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液
原则：确保平板上的菌落数在30 300之间。
三）微生物的培养与观察
1、接种：用适当的稀释液作涂布平板
2、培养：细菌：30 37℃，1 2d;
放线菌:25 28℃, 5 7d;
霉菌: 25 28℃, 3 4d.
3、观察：a.每24h统计一次菌落数目
b.以“稳定菌落”为观察对象
（四）鉴定：筛选后必鉴定
鉴别培养基：不影响微生物的生存
1、酚红培养基：
鉴定分解尿素的细菌。
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
2、伊红—美蓝培养基：
鉴定大肠杆菌。
原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→ 菌落呈深紫色并带有金属光泽。
筛选菌株
以尿素为唯一氮源
选择培养基
统计菌株数量
显微镜直接计数法
平板活菌计数法
原则
原理
操作
设置对照
鉴定
使用选择培养基的目的是（ ）
A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
下列说法不正确的是（ ）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多
为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
C
D
B
C(共10张PPT)
练习
1.下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( )
A．采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
C
2. 用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A.未接种的选择培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D.接种了的选择培养基
3．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他细菌分离开来，应将它们接种在（ ）
A．含五大类营养物质的培养基上
B．加入某种指示剂的鉴别培养基上
C．含蛋白胨等营养物质的培养基上
D．无氮的选择培养基上
D
C
4.在实验室里，从土壤里分离出自生固氮菌所需的培养基属于（ ）
A．天然培养基 B．鉴别培养基 C．选择培养基 D．液体培养基
5．在土壤中含有自生固氮微生物比较多的是（ ）
A．表层土壤 B．中层土壤
C．底层土壤 D．所有的土层都是一样的
C
A
6.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是
( )
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．菌落中的细菌数是固定的
C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同
C
7.现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分和含量如下表，用这两种培养基分别去分离土壤中的两种微生物，你认为它们适于分离( )
A.甲培养基适于分离自养型自生固氮菌；乙培养基适于分离异养型自生固氮菌
B.甲培养基适于分离异养型自生固氮菌；乙培养基适于分离自养型自生固氮菌
C.甲培养基适于分离酵母菌；乙培养基适于分离真菌
D.甲培养基适于分离自养型共生细菌；乙培养基适于分离异养型共生固氮菌
B
8.在农业生产研究上，常常需要进行微生物的培养和计数。
(1)如图是利用________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步________分散到培养基的表面。
(2)分析下面培养基的配方：NaNO3、KH2PO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、H2O。若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则应除去上述________成分，并加入________物质，以补充________源。如果要鉴别自来水中的大肠杆菌是否超标，至少要加入________和________。
平板画线
美蓝
伊红
氮
尿素
NaNO3
稀释
(3)三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下统计结果：,甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248；乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和250，取平均值233；丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；在三位同学的统计中，只有一位同学的统计是正确的，指出另两位同学的统计为什么不正确。
(4)若在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为233，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL)________。
1.165×109
乙同学是正确的
（233÷0.2）×106
9.(2008年高考广东卷)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株。筛选的主要步骤如下图所示：①为土壤样品。请回答下列问题
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源。②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量。如果要测定②中活细菌数量，常采用______法。
苯酚
A
平板活菌计数法
(2)④为对照，微生物在④中不生长、在⑤中生长。④与⑤培养基的主要区别在于_______________________________；使用________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？
_____________________________________________
(3)如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？
_____________________________________________
(4)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作
避免培养过程产生的水分影响微生物的生长
稀释涂布平板
④含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚为唯一碳源
用同样苯酚浓度的培养液培养不同菌株，一定时间后，测定培养液中苯酚含量
