(共25张PPT)
生物：１．３《基因工程的应用》（人教版选修３）
1.3 基因工程的应用
§1.3基因工程的应用
1、植物基因工程硕果累累
2、动物基因工程前景广阔
3、基因工程药物异军突起
4、基因治疗曙光初照
大豆、玉米、棉花、油菜已进入大规模商业化应用阶段
主要用于：提高农作物抗逆能力、改良农作物品质、利用植物生产药物
请同学们阅读P17-19思考以下几题:
1.目前用于杀虫的转基因抗虫植物基因有哪些
2.抗病转基因植物所采用的基因,使用最多的是什么
3.造成低产.减产的常见环境因素有哪些 使烟草.番茄的耐寒能力提高措施是什么
4. 豆类中哪种必需氨基酸较少 大米.玉米.小麦中哪种必需氨基酸较少 举例说明科学家如何提高氨基酸的含量
5.阅读相关内容后完成下表:
转基因生物与目的基因的关系
转基因生物 目的基因 从何来
抗虫棉基因
抗病毒转基因小麦
抗立枯丝核菌(真菌)的烟草
抗盐碱和干旱作物
耐寒的番茄
抗除草剂的大豆
富含赖氨酸的转基因玉米
转基因延迟番茄
转基因牵牛花
降低乳糖的奶牛
生产胰岛素的工程菌
Bt毒蛋白基因
苏云金芽孢杆菌
病毒外壳基因和病毒复制酶基因
几丁质酶基因和抗毒素合成基因
调节细胞渗透压的基因
抗冻蛋白基因
鱼
抗除草剂基因
富含赖氨酸的蛋白质编码基因
控制番茄果实成熟的基因
植物花青素代谢有关的基因
乳糖酶基因
人胰岛素基因
人
改良植物的品质
“金米的故事”：
将水仙花的两个基因和一种细菌的一个基因一起植入一种名为T309的水稻中，获得一种水稻新品种。这样获得的新水稻富含铁元素、锌元素和可转化为维生素A的胡萝卜素，能防止贫血和维生素A缺乏症，大米又呈金黄色。
“动物基因工程前景广阔”思考题:
1.如何利用动物基因工程技术提高动物的生长速率
2.怎样能在其他营养成分不受影响的情况下,降低乳糖的含量
3.目前科学家已在山羊等动物乳腺生物反应器中表达了抗凝血酶.血清白蛋白.生长激素和a-抗胰蛋白酶,科学家是怎样获得转基因动物的
乳腺（房）生物反应器
１、用动物乳房作为反应器生产的蛋白质比工厂生产有何优越性？
２、简述乳房生物反应器的操作过程？
３、乳房生物反应器的操作过程与转基因动物操作过程有何不同之处？并阐述原因？
要在编码蛋白质的基因序列前加上乳腺组织中特异
表达的启动子构成表达载体。因为产品在奶中形成，需要乳腺组织中特异表达的启动子。（基因的选择性表达）
产量高、质量好、成本低、易提取
例1、继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：
（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是___________。
（2）进行基因转移是，通常要将外源基因转____中，原因是 。
（3）通常采用 技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组
（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的 细胞中特异表达。
（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的 转入 细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为 。
显微注射
受精卵
受精卵具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达
DNA分子杂交
膀胱上皮
细胞核
去核的卵
核移植（或克隆）
例2、器官移植是治疗人类某些疾病的有效治疗方法，如对大面积烧伤病人采取的皮肤移植，肾衰竭病人的肾移植，冠心病人的心脏移植等。下面就器官移植的话题，回答相关问题：英国科学家已经研究用动物的器官作为器官移植的器官来源，科学家发现猪的内脏器官与人的内脏器官大小、形态均差不多，他们从20世纪80年代就开始研究。研究的重点是改造猪细胞膜。
（1）猪细胞膜的基本结构和人的细胞膜是相同的，但其上的 和人细胞膜有很多是不同的。
（2）改造猪细胞膜主要是通过 技术进行，具体操作步骤：
糖蛋白
基因工程
第一步，获得控制目的基因（人体细胞膜上蛋白质合成的基因），所用的方法有
。
第二步，将目的基因与 结合；
第三步，将目的基因导入受体细胞，对猪来说，应导入其 细胞最有效。
在这项技术中，必须使用的两种工具酶是 和 。
鸟枪法、反转录法、化学合成法
运载体
受精卵
限制酶
DNA连接酶
基因工程药物异军突起
转基因抗乙肝西红柿，虽然不能治愈乙肝，但一年只吃几个抗乙肝西红柿，就完全能代替注射乙肝疫苗。抗乙肝西红柿属于转基因食品，就是将乙肝疫苗植入西红柿内，经过多代繁殖，使转入的基因稳定化。这种西红柿培育历时十年，先是在实验室生长，等各种安全因素达标后，才移至户外，进行封闭种植。
例3、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。如右图，请据图回答问题。 (1)此图表示的是采取______________方法
获取_____________基因的过程。
人工合成基因
胰岛素（目的）
(2)图中①DNA是以____________为模板，_______形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的_______________。 (3)图中②代表的是_________________酶，在它的作用下将质粒切出_________末端。 (4)图中③代表重组DNA，含_______________基因。 (5)图中④表示的过程是_____________________。
胰岛素mRNA
逆转录
胰岛素（目的）基因
限制性核酸内切酶
黏性
胰岛素基因
重组DNA导入受体细胞
基因治疗的概念：
将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功效，从而达到治疗疾病的目的
免疫系统发挥正常作用的必须物质
腺苷酸脱氨酶 腺苷酸脱氨酶基因
体外基因治疗：从病人体内获取某种细胞进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩大培养，最后重新输入患者体内。
体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。
例4、基因治疗是指（ ）
A、把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗目的
B、对有缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗的目的
C、运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变，从而恢复正常
D、运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的
A
例5、患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或病毒感染，就会性病死亡。经过研究证实，SCID病人细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶的基因发生了突变。
（1）请你利用所学知识，设想一个治疗SCID病的方案。
第一步：发现人体正常ada基因克隆后用来替换反转录病毒的原有基因，构建重组载体；
第二步：从SCID病人体内分离出免疫系统有缺陷的T淋巴细胞
第三步： ；
第四步： ；
（2）还有哪些遗传病可用基因治疗的方案进行治疗？试举例。
将这些T淋巴细胞与携带了正常ada基因的反转录酶病毒混合在一起，让病毒感染T淋巴细胞，使正常的ada基因扩增并插入到T细胞的基因中；
在实验室中通过细胞培养并确认转入的基因成功表达后，用注射器将成千上万个重组的转基因T细胞注射到SCID患者的个体组织中。
血友病，镰刀型细胞贫血症。
例6、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指（ ）
A、用于检测疾病的医疗器械
B、用放射性同位素或萤光分子等标记的DNA分子
C、合成球蛋白的DNA
D、合成苯丙羟化酶的DNA片段
B(共50张PPT)
基因工程
专题1
每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。
1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。
治疗糖尿病特效药——
据WTO调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。
胰岛素
思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状
在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？
密码子在生物界是 的！
DNA(基因) mRNA 蛋白质(性状)
转录
翻译
通用
基因工程的产物
什么叫基因工程？
基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。
基因工程的概念
基因工程的概念
基因工程的别名
操作环境
操作对象
操作水平
基本过程
DNA重组技术
生物体外
基因
DNA分子水平
剪切
→ 拼接
→ 导入
→ 表达
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
早期基础理论
达尔文提出生物进化论
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
早期基础理论
孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
早期基础理论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
后期基础理论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
后期基础理论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
后期基础理论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
后期基础理论
克里克等提出中心法则
DNA
RNA
蛋白质
转录
翻译
逆转录
复制
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
后期基础理论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
基础理论和技术发展催生了基因工程
科技探索之路
1)基因转移载体的发现
2)工具酶的发现
3)DNA合成和测序技术的发明
4) DNA体外重组的实现
5)重组DNA表达实验的成功
6)第一例转基因动物问世
7)PCR技术的发明
问题探讨：
苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。
让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。
想一想需要做哪些关键工作？
苏云金芽孢杆菌
毒蛋白
普通棉花 抗虫棉
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
在以上过程中关键步骤或难点是什么？
普通棉花(无抗虫特性)
苏云金芽孢杆菌
提取
抗虫基因
通过运载体导入
转基因棉花含抗虫基因
转基因棉花产生伴胞晶体
转基因棉花有抗虫特性
基因工程培育抗虫棉的关键步骤：
关键步骤一：
抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来
关键步骤二：
抗虫基因与棉花DNA“缝合”
关键步骤三：
抗虫基因进入棉花细胞
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶
关键步骤一：
抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来
关键步骤二：
抗虫基因与棉花DNA“缝合”
关键步骤三：
抗虫基因进入棉花细胞
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
1.1、DNA重组技术的基本工具
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1.主要来源：
⒉种类与命名：
⒊作用特点（特异性）
4.限制酶识别序列
5.作用结果：
识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
主要从原核生物中分离纯化
产生黏性末端或平末端
Go on
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
寻根问底
你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
思考与探究 P7 （2）
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。
EcoRⅠ
SmaⅠ
粘质沙雷氏杆菌
（Serratia marcesens）
大肠杆菌
（Escherichia coli R）
Go back
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
磷酸二酯键
T
1
2
3
4
5
A
1
2
3
4
5
H
H
H
H
HO
T
1
2
3
4
5
A
1
2
3
4
5
H
H
H
H
O
H2O +
O
限制酶 DNA解旋酶
区别
限制性内切酶与DNA解旋酶的区别
切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键
将DNA两条链的氢键打开形成两条单链
限制酶 DNA水解酶
区别
限制性内切酶与DNA水解酶的区别
切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.
切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。
限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
Go back
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
重复演示
什么叫黏性末端？
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
SmaⅠ
平末端 平末端
限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。
想一想限制酶所识别的序列有什么特点？
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。
思考
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
EcoRⅠ
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
不同来源的DNA片段混合
将不同种来源的DNA片段连接起来
生物A基因片段
生物B基因片段
……G AATTC……
……CTTAA G……
酶切
……GAATTC……
……CTTAAG……
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC……
……CTTAA G……
同一种
DNA聚合酶 DNA连接酶
区别1
区别2
相同点
寻根问底
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么
1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键
形成磷酸二酯键
1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链
2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板
Go on
二、“分子缝合针” —— DNA连接酶
①作用:
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
②作用原理：
催化磷酸二酯键形成
③类型：
类型
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·coli DNA连接酶 或T4DNA连接酶
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
T4DNA连接酶
三、“分子运输车” ——基因进入受体细胞的载体
⒈载体需要的条件：
⑴有1~多个限制酶切点
⑵对受体细胞无害
⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达
⑷有某些标记基因，便于筛选
⒉常用运载体：
⑴细菌的质粒
⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒
⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？
⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？
⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？
⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？
常用的载体：质粒
能复制并带着插入的目的基因一起复制
有切割位点
有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别
2
7
4
8
3
6
1
5
…CTGCAG… …GADGTC…
…ACGT… …TGCA…
…GCGC… …CGCG…
…GAATTC… …CTTAAG…
思考与探究 P7
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示：
基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。
是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？
不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
思考与探究 P7
1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
思考与探究 P7
1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）
同种限制酶 B. 两种限制酶
同种连接酶 D. 两种连接酶
A
课堂练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 （ ）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
D
课堂练习
3.以下说法正确的是 （ ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
C
课堂练习
下课了!(共28张PPT)
生物：１．４《蛋白质工程的崛起》课件PPT（人教版选修３）
§1.4 蛋白质工程的崛起
旁栏思考题
你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？
人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。
“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织／器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。
人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。
基因工程的实质是什么
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本来不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。
干扰素
利用大肠杆菌及酵母菌生产干扰素
一、蛋白质工程崛起的缘由
通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。
在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。
例如:干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的β-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然β-干扰素的贮存稳定性高很多。
“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。
蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。
1.4 蛋白质工程的崛起
一、蛋白质工程崛起的缘由
1、基因工程在原则上只能生产自然
界已存在的蛋白质
2、天然蛋白质不一定完全符合人类
生产和生活的需要
蛋白质工程的目的：
生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质
例如
二、蛋白质工程的基本原理
１、蛋白质工程的目标 P26
２、蛋白质工程流程图：P27
（原理：基因改造）
蛋白质
三维结构
氨基酸序列
多肽链
基因
DNA
预期功能
DNA合成
分子设计
mRNA
生物功能
转录
翻译
中心法则？
折叠
P27讨论题
蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？
答：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。
4.蛋白质工程的主要步骤通常包括：
（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；
（2）测定其氨基酸序列；
（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;
（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；
（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；
（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。
（一）蛋白质的分子设计与改造
蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。
蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果，蛋白质工程则是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从新设计再进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的预定目标。
（二）蛋白质改造工程举例
1．水蛭素改造
水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。
2．生长激素改造
生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。
3．胰岛素改造
天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。
4．治癌酶的改造
癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基3’-OH缺乏,从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。HSV—TK催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。
蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。
何谓蛋白质工程？
5. 在现代生物技术中，蛋白质工程出现得最晚，是在20世纪80年代初期出现的。1983年 “蛋白质工程”这个名词出现后，随即被广泛接受和采用。
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。
三、蛋白质工程的进展和前景
蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。
练习
1、以下关于蛋白质工程的说法正确的是：( )
A. 蛋白质工程以基因工程为基础
B. 蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造
C. 蛋白质工程只能生产天然的蛋白质
D. 蛋白质工程的实质是改造蛋白质
A
2、蛋白质工程的基本流程正确的是：( )
①设计蛋白质分子结构 ②DNA合成
③预期蛋白质功能 ④据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列
A. ①→②→③→④
B. ④→②→①→③
C. ③→④→①→②
D. ③→①→④→②
D
讨 论
答：（1）每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种，可以根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出mRNA序列为GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。
（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
（1）干扰素在体外保存困难
（2）玉米中赖氨酸的含量低
解决方法 ：
解决方法 ： 半胱氨酸 丝氨酸
变成
天冬氨酸激酶：苏氨酸 异亮氨酸
变成
二氢吡啶二羧酸合成酶：天冬酰胺 异亮氨酸
变成(共58张PPT)
1.2 基因工程的基本操作程序
教学目标
1、简述基因工程原理及基本操作程序
2、尝试设计某一转基因生物的研制过程
教学重点
基因工程操作的四个步骤
教学难点
1、从基因文库中获取目的基因
2、利用PCR技术扩增目的基因
补：原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚酶结合位点
启动子
终止子
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
①不能转录为信使RNA，不能
编码蛋白质。
：能转录相应的信使RNA，能
编码蛋白质
编码区
非编码区
原核细胞的 基因结构
②有调控遗传信息表达的核
苷酸序列，在该序列中，
最重要的是位于编码区上
游的RNA聚合酶结合位点。
启动子
补：真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚酶
结合位点
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的 基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列，
包括位于编码区上游的RNA
聚合酶结合位点。
非编码序列：
包括非编码区和内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是
_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
不一样.真核细胞基因结构要长一些.
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
一、目的基因的获取
(一)、目的基因主要是______________________
编码蛋白质的结构基因
请举出三个以上的例子
（二）、获取目的基因的常用方法有哪些
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
请阅读P9第一和二两段
一、目的基因的获取
（一）从基因文库中直接获取
1.基因文库：概念见P9
2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类
种类
基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
3.基因文库的目的
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
4.获取目的基因的根据：
见课本P9
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
5.基因文库的构建方法之一
（1）直接分离法(鸟枪法)
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
反转录法：cDNA的合成流程图解
5.基因文库的构建方法之
基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较
概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
原理：
DNA复制
2、利用PCR技术扩增目的基因
四种脱氧核苷酸(dNTP)
一对引物：
热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
模板DNA( 需含有目的基因 )
Mg2+(激活剂)
条件：
缓冲溶液
一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物
前提：
过程
高温变性（解旋为单链）
低温退火（引物与单链互补结合）
适温延伸（在Taq酶的作用下合成
与模板互补的DNA双链）
重复循环
预变性（增加DNA变性的概率）
2、具体过程
PCR(多聚酶链式反应)
① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、
_______________、___________ 、 ___________.等
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）
⑤结果：
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
四种脱氧核苷酸
一对引物
DNA聚合酶
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，
合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
1）反转录法：
以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
3、人工合成的目的基因
1）以下说法正确的是 （ ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
C
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 （ ）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
D
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
B、 限制性内切酶可用于目的基因的获得
C、目的基因须由运载体导入受体细胞
D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
A
练习
4、 PCR技术扩增DNA,需要的条件是( )
①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体
A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥
巩固练习
A
5、 获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（ ）
A、从基因组文库中获取
B、从cDNA文库中获取
C、从含目的基因生物细胞中获取
D、利用PCR技术获取
练习
C
第2课时
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
1、目的：
所需物质：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
它们各自的作用是什么
2、基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自的作用是什么
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
1、将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程：
④优点
（2）基因枪法
（3）花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少
②方法：
用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
（一）、检测
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤)
①.首先取出转基因生物的基因组DNA
②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
（1）方法:
DNA分子杂交
（2）过程:
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
P15思考与探究
（二）、鉴定（个体生物学水平）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①方法:
分 子 杂 交
方法:
抗原抗体杂交
②过程:
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
鉴定——
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原抗体杂交
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
鉴定：
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）
a
a
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
基因枪法（花粉管通道法）
植物组织培养
脱分化和再分化
耐盐基因
一定浓度盐水浇灌
1）以下说法正确的是 （ ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
C
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 （ ）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
D
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
B、 限制性内切酶用于目的基因的获得
C、目的基因须由运载体导入受体细胞
D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
A
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用
B、重组质粒的形成在细胞内完成
C、质粒都可作为运载体
D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
D
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
C
练习
知识点一：1.原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)
①不能转录为信使RNA，不能
编码蛋白质。
：能转录相应的信使RNA，能
编码蛋白质
编码区
非编码区
原核细胞的 基因结构
②有调控遗传信息表达的核
苷酸序列，在该序列中，
最重要的是位于编码区上
游的RNA聚合酶结合位点。
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
知识点一：2.真核细胞的基因结构
真核细胞的 基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列，
包括位于编码区上游的RNA
聚合酶结合位点等。
非编码序列：
包括非编码区和内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是
_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
