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1.3
基因工程的应用
专题一
基因工程
脑洞大开
抗病毒基因
鱼类的抗冻蛋白基因
萤火虫的荧光基因
乌龟的长寿基因
人类胰岛素的合成基因
富含赖氨酸的蛋白质合成基因
植物花青素（花色）代谢有关的基因
根据基因工程的原理我们可以利用下面这些基因培育什么样的个体呢？
受体细胞
=
导入
？
目
录
植物基因工程
01
基因工程药物的生产
03
动物基因工程
02
基因治疗
04
01
植物基因工程
植物基因工程在农业中的应用发展迅速。2001年，就世界范围来看，转基因植物面积首次突破5×106hm2。其中转基因大豆、棉花、油菜、玉米已进入大规模商业化应用阶段，这四种转基因作物种植面积占相关作物种植面积的比例已达到：大豆63%，玉米19%，棉花13%，油菜5%。
我国转基因作物的种植面积也迅速增长，目前已位居世界第四。
转入外源基因的植（动）物
转基因植（动）物：
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂，抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等）,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
一
、植物基因工程硕果累累
①
②
③
①抗虫转基因植物：
从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，导入农作物，使其具有抗虫性，已成为防治作物虫害的发展趋势。
Bt毒蛋白基因、
蛋白酶抑制剂基因、
淀粉酶抑制剂基因、
植物凝集素基因等
用于杀虫的基因主要是
:
我国转基因抗虫棉
优点：减少环境污染、减低生产成本、提高产量
图为
苏云金芽孢杆菌
为什么Bt毒蛋白对哺乳动物无毒害作用？
特异性受体
Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出的抗虫基因，该基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道，在消化酶的作用下，水解成分子质量较小的有毒多肽，这些多肽结合在肠上皮细胞的特异性受体上，导致细胞膜穿孔，细胞肿胀裂解。最后造成害虫死亡。
蛋白酶抑制剂基因广泛存在于植物中，该基因产生的抑制剂可与害虫消化道内的蛋白酶结合，阻断或降低蛋白酶的活性，使害虫不能正常消化食物，还会引起厌食反应。
淀粉酶抑制剂基因产生的抑制剂可与害虫消化道内的淀粉酶结合。
植物凝集素基因会控制合成一种糖蛋白，这种糖蛋白可与害虫肠道黏膜上的某种物质结合，影响害虫对营养物质的吸收和利用。
①
抗虫转基因植物：
②抗病转基因植物：
引起植物生病的微生物，称病原微生物；如病毒、真菌和细菌等。
目前人们已获得：
抗烟草花叶病毒的转基因烟草
抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等。
病毒外壳蛋白基因（CP基因）
病毒的复制酶基因
抗病毒基因：
几丁质酶基因
抗毒素合成基因
抗真菌基因：
抗病毒转基因甜椒
③抗逆转基因植物
调节细胞渗透压的基因
鱼的抗冻蛋白基因
抗除草剂基因
造成低产、减产的常见因素有
盐碱、干旱、低温、涝害等。
用于抗逆的基因主要是
:
抗盐碱和干旱
耐寒
利用转基因改良植物品质
1、使食品的营养成分均衡
科学家们将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物，或改变这种氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。
我国科学家培育出了赖氨酸含量提高30%的转基因玉米。
豆类食品含蛋氨酸比较少，大米、玉米、小麦则含赖氨酸比较少。这些人体必需氨基酸的缺少对健康很不利。
利用转基因改良植物品质
番茄富含维生素，但不耐储存。
我国科学家将控制番茄成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄。储存时间可延长1-2个月，有的可达80多天。
2、转基因耐储存番茄
利用转基因改良植物品质
3、转基因矮牵牛花
将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色。
科学家研究发现，萤火虫发光是发光器中的荧光素，在荧光酶的催化作用下，发出的间歇光。
1997年，美国科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达，长成的植物通体光亮。
02
动物基因工程
动物基因工程使20世纪80年代开始发展起来的，它从诞生那天起，就在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等很多方面显示了广阔的应用前景。
①
②
③
④
1.用于提高动物生长速度
科学家们将外源生长激素基因，导入动物体内，以提高动物生长速率。得到了转基因绵羊和转基因鲤鱼。
2.用于改善畜产品的品质
例如，有些人食用牛奶后，对牛奶中的乳糖不能完全消化，也有人出现过敏、腹泻、恶心。
科学家们将肠乳糖酶基因，导入奶牛基因组，获得的转基因奶牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，而其他营养成分不受影响。
优点：避免食物过敏、腹泻、恶心等不适
3.用转基因动物生产药物
将哺乳动物本身，变成“批量生产药物的工厂”。
将
_____与
等调控组件重组在一起，通过
方法，导入哺乳动物的
中，将其送入母体，使其发育成转基因动物。
乳腺蛋白基因的启动子
药用蛋白基因
显微注射
受精卵
转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需药品,因而称为乳房（乳腺）生物反应器
产量高；质量好；成本低；易提取
动物进入泌乳期
（分泌的乳汁中包
含所需要的药物）
构建基因表达载体
（药用蛋白基因与乳腺蛋白基因
的启动子等调控组件重组）
获取目的基因
（药用蛋白基因）
显微注射
（哺乳动物受精卵中）
形成胚胎
发育成转基因动物
（只有在产下的雌性动物个体
中，转入的基因才能表达）
优点：
将胚胎送入
母体动物
乳房（乳腺）生物反应器
将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，然后将受精卵送入母体，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产所需的药品。
乳房（乳腺）生物反应器
1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。
2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。
3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。
为什么动物的乳腺细胞能成为基因药物最理想的表达场所呢？
乳房（乳腺）生物反应器
缺点：雌性个体发育到一定时期才会合成
膀胱生物反应器：
优点：处于不同发育时期的雌雄动物都可以生产药物。
将
_____与
等调控组件重组在一起，通过
方法，导入哺乳动物的
中，将其送入母体，使其发育成转基因动物。
膀胱蛋白基因的启动子
药用蛋白基因
显微注射
受精卵
乳汁中含有人生长激素的转基因牛
4.用转基因动物作器官移植的供体
由于人体移植器官短缺是世界性难题，人们不得不寻找可替代的移植器官。
猪与人：
1.
器官大小一致
2.
解剖生理特点相似
3.
组织相容性抗原同源性高
4.
人畜共患疾病病原体少
最大的难题：
存在
反应。
免疫排斥
科学家们正试图利用基因工程对猪器官进行改造。
向器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达；或设法除去抗原决定基因。
4.用转基因动物作器官移植的供体
项目
应用
基因来源或处理
成果
提高动物的生长速度
外源
基因
转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善畜产品的品质
肠乳糖酶基因
转基因牛分泌的乳汁中_____
含量大大减低
转基因动物生产药物
蛋白基因＋乳腺蛋白基因的
等
乳腺(房)生物反应器
用转基因动物作器官移植的供体
抑制或除去____________
结合克隆技术培育出没有________的转基因克隆猪器官
生长激素
乳糖
药用
启动子
抗原决定基因
免疫排斥反应
03
基因工程药物的生产
【资料1】：胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4－5g胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。
将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!
【资料2】：干扰素是动物或人体细胞受到病毒感染后产生的一种糖蛋白。干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！对癌症也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。
科学家利用基因工程，从1kg细菌培养液中可20-40mg干扰素。
20世纪90年代以来，我国自己生产的白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等近20种基因工程药物投放市场，年产值达30亿元人民币。
主要用于治疗乙肝的重组人干扰素α-1b（安达芬）是我国第一个国内批准生产的基因工程药物，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。
【易错点拨】
1.疫苗在免疫学上属于
；如：利用基因工程技术产生乙肝疫苗实际上是将乙肝病毒的
基因导入受体细胞中并表达
2.干扰素的化学本质是
，其为抗
药物；
抗生素为抗
药物。
抗原
表面抗原
蛋白质
病毒
细菌
可用来治疗侏儒症。生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。
现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从
450
L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。
基因工程药品
——
生长激素
04
基因治疗
基因治疗
基因治疗，是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。
注意：①并非把正常的外源基因导入病人的所有细胞中，而只是导入某些功能细胞中。
②正常基因表达
缺陷基因的功能
替代
原来体内的缺陷基因并没有被清除或者替换掉；缺陷基因与新导入的正常基因同时存在。
【资料1】：1990年，美国对一名严重复合型免疫缺陷症的4岁女童，实施了基因治疗。由于腺苷酸脱氨酶（ADA）基因的缺失，造成体内缺乏腺苷酸脱氨酶（ADA）；而该酶是人体免疫系统发挥正常功能作用所必需的，因此，女童不能抵抗病原微生物的威胁，只能生活在无菌的隔离帐里。
研究人员将她的T淋巴细胞取出，通过基因工程将腺苷酸脱氨酶基因转入T淋巴细胞，然后再将这种淋巴细胞转入患者体内。半年后，在血液中检测出了被改造的淋巴细胞，产生的腺苷酸脱氨酶也越来越多，免疫能力显著提高。
体外基因治疗
基因治疗：
体外基因治疗：
优点：风险较小
缺点：步骤较多、费用较高
【资料2】：1994年，美国科学家成功地利用修饰的腺病毒作为载体，将正常的相关基因转入遗传性囊性纤维化病的患者肺组织中。
体内基因治疗
基因治疗：
风险较大
体内基因治疗：
基因治疗，是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。
类型：
体外基因治疗
体内基因治疗
操作复杂，但效果较为可靠
方法较简单，但效果难以控制
目前两种方法都处于临床试验阶段
基因治疗：
思考：用于基因治疗的基因种类有哪些？
分别如何发挥作用？
从健康人体上分离得到的功能正常的基因
取代病变基因或依靠表达产物弥补病变基因带来的生理缺陷
反义基因
通过转录产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，来阻止非正常蛋白的合成。
自杀基因
编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因。
神奇的基因芯片
1.
什么是基因芯片？
2.
基因芯片主要用于什么工作？其原理是什么？
3.
基因芯片还有哪些用途？
4.
基因芯片在临床诊断方面表现出的独特优势有哪些？
5.
基因芯片诊断技术有何特点？
神奇的基因芯片
生产基因工程药品
基因工程与医药卫生
基因诊断
基因治疗
如胰岛素、干扰素
如用基因探针检测肝类病毒、诊断遗传病
把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的
有没有病
有病治病
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专题一
基因工程
1.2
基因工程的基本操作程序
回顾复习：
关于基因
基因是决定生物性状的基本单位
01
基因是具有遗传效应的DNA片段。
03
DNA分子具有多样性和特异性。
05
基因在染色体上呈线性排列。
02
每个基因都有特定的脱氧核苷酸排列顺序
04
复
制
转
录
翻
译
场所
模板
原料
碱基
配对
产物
遗传
信息
回顾复习：
复制、转录和翻译的比较
细胞核
细胞核
核糖体
DNA两条链
DNA的一条链
mRNA
脱氧核苷酸
核糖核苷酸
氨基酸
A—T，
C—G
A—U，
T—A
A—U，
C—G
2个相同
的DNA
rRNA、tRNA
mRNA
多肽链
亲代DNA→
子代DNA
DNA
→mRNA→氨基酸序列
知识延伸：
基因的结构
1、原核细胞的基因结构：
知识延伸：
基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的
一条链为模板合成RNA。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
1、原核细胞的基因结构：
①不能转录为信使RNA，
不能编码蛋白质。
：能转录相应的信使RNA，
能编码蛋白质
编码区
非编码区
原核细胞
基因结构
②有调控遗传信息表达的核
苷酸序列.包括启动子和终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
1、原核细胞的基因结构：
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
转录
mRNA前体
加工
翻译
肽链
启动子
终止子
成熟mRNA
能够编码蛋白质的序列。
不能够编码蛋白质的序列。
外显子:
内含子:
编码区
2、真核细胞的基因结构：
真核细胞的
基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列，
包括启动子和终止子
非编码序列：
包括非编码区和内含子
编码区
非编码区
非编码区
启动子
终止子
2、真核细胞的基因结构：
非编码区
非编码区
编码区
RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
终止子
启动子
原核
真核
知识延伸：
基因的结构
3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是
_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
思考:
编码相同数目氨基酸的蛋白质，
原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较
知识延伸：
基因的结构
启动子
终止子
mRNA
起始密码子
终止密码子
转录
ＲＮＡ聚合酶识别和结合的部位
翻
译
多肽链
启动转录
终止转录
启动翻译
终止翻译
4、比较启动子、起始密码子、终止子、终止密码子
DNA
RNA
基因工程的基本操作步骤:
①提取
②与运载体DNA拼接
③导入
“分子手术刀”——
限制性核酸内切酶
“分子缝合针”——
DNA连接酶
“分子运输车”——
基因进入受体细胞的载体
目的基因的获取
1
基因表达载体的构建
2
3
将目的基因导入
受体细胞
4
目的基因的检测
与鉴定
基因工程的基本操作的四个步骤：
2．什么叫目的基因？并举例说明。
1．什么是基因？基因的结构如何?
3．获取目的基因的常用方法有哪些？
一、目的基因的获取
学习重点：
1．什么是基因？基因的结构如何?
基因是具有遗传效应的DNA片段。
原核生物
真核生物
一、目的基因的获取
1．什么是基因？基因的结构如何?
一、目的基因的获取
主要是编码蛋白质的基因，
也可以是一些具有调控作用的因子。
（1）从基因文库中获取
（2）利用PCR技术扩增
（3）人工合成
2．什么叫目的基因？并举例说明。
一、目的基因的获取
3．获取目的基因的常用方法有哪些？
3、获取目的基因的方法:①从基因文库中获取目的基因
(1).概念：
将某种生物全部DNA提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，分别与载体连接，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
(2).种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
(3).目的：
在不知目的基因序列的情况下，获得所需的目的基因。
(4).构建：
(5).获取：
(4).基因文库的构建
①基因组文库的构建
3、获取目的基因的方法:①从基因文库中获取目的基因
与载体连接导入受体菌群
用适当限制酶切割
提取某生物
全部DNA
许
多
DNA片段
该生物的
基因组文库
(4).基因文库的构建
3、获取目的基因的方法:①从基因文库中获取目的基因
与载体连接
导入受体菌群
②cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
mRNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
(cDNA)
该生物的
cDNA文库
第一步：以mRNA为模板,在反转录酶的作用，形成RNA-DNA杂交分子。
第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。
第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
基因组文库
与
cDNA文库的比较
基因组文库
3、获取目的基因的方法:①从基因文库中获取目的基因
基因组文库
cDNA文库
基因文库类型
cDNA文库
基因组文库
构建基因文库
的过程
某种生物某个时期的mRNA
反转录
cDNA
与载体连接导入
受体菌群体
某生物内部全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与载体连接导入
受体菌群体
文库大小
小
大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
基因组文库
与
cDNA文库的比较
村长,
为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？？？
当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全不知道目的基因序列，或者想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在不同的发育阶段都表达哪些基因，或者想得到一种生物的全部基因序列，往往就需要构建基因文库。
基因文库构建好了，怎么从中得到我们所需的目的基因呢？？？
目前来说，这还是一件比较复杂的。事情，简单的说就是根据目的基因的相关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
(5).如何从基因文库中得到所需要的目的基因？
3、获取目的基因的方法:①从基因文库中获取目的基因
(5).如何从基因文库中得到所需要的目的基因？
3、获取目的基因的方法:①从基因文库中获取目的基因
DNA
附着在膜上
硝化纤维素
加探针
报告基因（含荧光素分子）
变性
DNA杂交
（如检测SARS病毒等）
a
b
c
d
PCR扩增仪
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
1．RCR
的中文全称？PCR是一项什么样的技术？
2．PCR原理？利用这一技术获取目的基因的前提？
3．PCR的过程？这一过程利用了什么酶？
4．通过PCR使目的基因的数目如何增长？
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
学习重点：
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
(1)．概念：PCR全称为________________，是一项在生物
____复制_____________的核酸合成技术。
(3)．条件：
(2)．原理：
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA双链复制
模板
原料：脱氧核苷酸（dNTP）
引物（一小段单链DNA或RNA）
热稳定DNA聚合酶（
Taq酶）
(4)．操作前提：
已知一段目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。
缓冲溶液
酶：
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
什么是“引物”，为什么需要“引物”？
由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从DNA的3‘端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。
引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
(5)．过程：
变性、复性、延伸三步曲
延伸：加热至72℃
Taq酶以目的基因为模板，从引物开始，合成互补的新DNA链
变性
复性
延伸
变性：加热至95℃
双链DNA解链成为单链DNA
复性：冷却至55℃
引物结合到互补的DNA链上
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
以_____方式扩增，
即____（n为扩增循环的次数）
指数
2n
(6)．扩增形式:
在短时间内大量扩增目的基因
(7)．扩增结果:
3、获取目的基因的方法:②利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原料
条件
不同点
解旋
方式
场所
酶
结果
四种脱氧核苷酸（dNTP）
模板、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内（主要）
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
目的基因的mRNA
单链DNA
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
（1）反转录法：
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
目的基因的核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
（2）化学合成法：（根据已知氨基酸序列合成DNA的方法）
(1).适用对象：
基因较小，核苷酸序列已知
(2).方法：
以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
3、获取目的基因的方法:③人工合成目的基因
3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________
1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用____________
2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用________________
PCR技术扩增
化学方法人工合成
构建基因文库的方法
总结归纳：
获取目的基因的三种方法应用
基因工程的基本操作步骤:
目的基因的获取
1
基因表达载体的构建
2
二、基因表达载体的构建——
核心
1．如何构建基因表达载体？
2．基因表达载体构建的目的？
3．基因表达载体的组成？
4．启动子、终止子、标记基因的作用分别是？
学习重点：
1．基因表达载体构建的目的？
构建表达载体可以使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。
单独的DNA片段─目的基因是不能稳定遗传的。
二、基因表达载体的构建——
核心
2．如何构建基因表达载体？
质粒
DNA分子
限制酶切割
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶连接
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
二、基因表达载体的构建——
核心
用同一种限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体质粒，产生相同的粘性末端。
质粒
目的基因
切口
用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。
二、基因表达载体的构建——
核心
如果用同一种限制酶（EcoRI酶）切割目的基因
和质粒
,再用DNA连接酶的作用后，会有几种连接产物（不考虑3个及以上的切割产物连接情况）？
二、基因表达载体的构建——
核心
两两连接
两两连接
自身环化
3．基因表达载体的组成？
⑤（复制原点）
①启动子
②目的基因
③终止子
④标记基因
二、基因表达载体的构建——
核心
4．启动子、终止子、标记基因的作用分别是？
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止转录。
标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
二、基因表达载体的构建——
核心
基因工程的基本操作步骤:
目的基因的获取
1
基因表达载体的构建
2
3
将目的基因导入
受体细胞
1．转化的概念
2．将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别有哪些？
三、将目的基因导入受体细胞
学习重点：
1.转化：
2.方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
三、将目的基因导入受体细胞
（1）农杆菌转化法
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
②原理：
思考：如果想用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物，该如何做？
1．将目的基因导入植物细胞的方法：
①农杆菌特点：
趋化性（酚类化合物）
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程：
④优点：
将外源目的基因插入Ti质粒的T-DNA中形成重组Ti质粒
将重组Ti质粒转入农杆菌
使含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞
含目的基因的植物细胞
表现出新性状的植株
稳定、经济、有效
1．将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法
（2）基因枪法
又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
单子叶植物常用的基因转化的方法，但成本较高。
1．将目的基因导入植物细胞的方法：
（3）花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
我国科学家独创方法，十分简便经济，我国的转基因抗虫棉就是采用的此方法。
1．将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是？
（2）农杆菌如何感染植物细胞？
（3）农杆菌的Ti质粒中Ｔ－ＤＮＡ有何特点？
（4）若用农杆菌转化法应选用什么作为运载体？将目的基因插入运载体的什
么部位？此时的农杆菌是受体细胞吗？
（5）获得含有目的基因的受体细胞后如何获得具有新性状的植物体？原理？
（6）农杆菌转化法和基因枪法分别适用于什么生物？
总结归纳：
②程序：
2．将目的基因导入动物细胞
①方法：
显微注射法
是目前最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法
提纯含目的基因表达载体
取受精卵
显微注射
胚胎培养
胚胎移植到子宫
发育成新性状动物
显微注射技术
动物的受体细胞主要是什么？
受精卵
2．将目的基因导入动物细胞
（1）早期基因工程为何选择原核生物作为受体细胞？
3．将目的基因导入微生物细胞
原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少
用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
（2）感受态细胞：
感受态细胞法：
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
转化
繁殖
感受态细胞易于吸收外源DNA
3．将目的基因导入微生物细胞
（1）早期基因工程为何选择原核生物作为受体细胞？
3．将目的基因导入微生物细胞
原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少
用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
（2）感受态细胞：
（3）方法：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2+处理法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
基因工程的基本操作步骤:
目的基因的获取
1
基因表达载体的构建
2
3
将目的基因导入
受体细胞
4
目的基因的检测
与鉴定
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？
怎样鉴定基因表达载体是否导入受体细胞中：
1、目的基因检测的过程分为哪几步？分别用什么方法？2、鉴定（个体生物学水平）方法？
四、目的基因的检测与鉴定
学习重点：
检测
—
（分子检测）
鉴定
——
（个体生物学水平）
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
四、目的基因的检测与鉴定
若外源DNA插入后，使整个DNA的GC含量过高，受体细胞会使外源DNA甲基化，不能转录；
某种蛋白质会与启动子结合，阻止外源基因开启转录过程
mRNA合成后，可能被相应的酶直接水解；
基因沉默
分子检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
A．首先取出转基因生物的基因组DNA。
B．对含目的基因的DNA片段作放射性同位素标记，以此做探针。
C．使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中。
（1）方法:
（2）原理:
DNA分子杂交
碱基互补配对原则
（3）过程:
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测示意图
分子检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
分子检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
14N
14N
变性
变性
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA。
方法:
原理:
分子杂交（DNA——mRNA）
碱基互补配对原则
过程:
分子检测：②检测目的基因是否转录出了mRNA
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
14N
14N
四、目的基因的检测与鉴定
方法:
抗原——抗体杂交
1.谁充当抗原？
思考:
2.抗体如何获得？
目的基因所表达的蛋白质充当抗原
可将抗原注射给动物体内，从血清中提取相应抗体。
分子检测：③检测目的基因是否翻译成蛋白质
四、目的基因的检测与鉴定
提取
方法——抗原-抗体杂交
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
荧光标记
细胞提取液
混合
分子检测：③检测目的基因是否翻译成蛋白质
四、目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平鉴定——
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未导入目的基因或导入的目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明导入了抗虫基因并得到表达。
思考：若培育耐盐碱的水稻，如何进行个体生物学水平鉴定？
盐碱地种植，观察其生长状况。
四、目的基因的检测与鉴定
②mRNA
③蛋白质
目的基因
是否插入
检测：
现象：
DNA分子杂交
是否出现杂交带
转录
mRNA
分子杂交
是否出现杂交带
翻译
蛋白质
抗原-抗体杂交
是否出现杂交带
个体
抗虫、抗病接种实验
是否抗虫、抗病
分子水平
个体水平
小结：目的基因的检测与鉴定
受体细胞
①DNA
如将含胰岛素基因的表达载体成功导入到大肠杆菌中，
产生的胰岛素没有生物活性，原因是
。
大肠杆菌没有内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工
基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取
二、基因表达载体的构建（核心）
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
1、从基因文库中获取目的基因
2、利用PCR技术扩增目的基因
3、化学方法人工合成
①复制原点
+②
目的基因
+
③启动子
+
④终止子
+⑤
标记基因
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法
DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术
分子检测外的个体水平鉴定
课堂小结：
谢谢观赏
四、目的基因的检测与鉴定
（1）如何知道目的基因是否进入受体细胞？
（2）怎样检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因？
（3）如何检测受体细胞中目的基因是否转录出了mRNA？
（4）如何检测目的基因是否翻译成蛋白质？
①
②
③
1、利用标记基因（抗生素抗性基因）进行筛选。
利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆
检测方法：
1、DNA分子杂交技术
检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；(共28张PPT)
由血栓引起的心脑血管疾病给人类健康造成极大危害，溶栓疗法是治疗血栓的重要措施。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)能激活纤溶酶原转化为纤溶酶，将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，而保持血管畅通。但t-PA用于溶栓治疗时具有一定的局限性，它进入血浆后大部分
与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，并迅速失
去活性。利用蛋白质工程技术对t-PA进行改造，
就可以消除上述缺点，增加溶栓效能、减少药用
剂量和降低副作用等（如图)。
人类是怎样实现对蛋白质的定点改造的？这种改造对蛋白质的结构和功能有什么影响？
1.4
蛋白质工程的崛起
专题1
基因工程
目录
一、蛋白质工程概述
01
二、蛋白质工程的应用
02
三、蛋白质工程与基因工程的比较
03
四、蛋白质工程的进展和前景
04
1.
基因工程在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质（天然蛋白）
2.
天然蛋白有时不完全符合人类生产和生活需要
3.
需要对天然蛋白进行改造产生更符合人类需要的蛋白质
思考：分子生物学、晶体学以及计算机技术是改造蛋白的基础，对天然蛋白质的改造应该是直接对蛋白质分子改造还是通过改造基因进而达到改造蛋白质的目的呢？
蛋白质工程崛起的缘由：
1.蛋白质工程的概念
蛋白质工程（protein
engineering)是指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。
(1)基础：蛋白质分子的
及其与
的关系。
结构规律
生物功能
(2)手段：通过
或
，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
(3)目标：定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术
基因修饰
基因合成
2.蛋白质工程一般过程
中心法则：
转录
DNA
RNA
翻译
蛋白质
逆转录
复制
复制
翻译
折叠
3.蛋白质工程一般过程示意图
蛋白质
三维结构
预期功能
生物功能
分子设计
氨基酸序列
多肽链
DNA合成
基因
DNA
转录
mRNA
速效
胰岛素
B链中28号与29号氨基酸对换
速效胰岛素两条多肽链氨基酸序列
速效
胰岛素
基因
转录
速效
胰岛素
mRNA
翻译
折叠
实例：
改造
干扰素（半胱氨酸）
体外很难保存
干扰素（丝氨酸）
体外可以保存半年
提高在低温的保存时间
P27----某多肽的一段氨基酸序列是：
．．．—丙氨酸－色氨酸－赖氨酸－甲硫氨酸－苯丙氨酸-．．．
讨论：
1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？写出相应的碱基．
丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG
色氨酸：UGG
赖氨酸：AAA、AAG
甲硫氨酸：AUG
苯丙氨酸：UUU、UUC
2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？
（1）mRNA序列为：
GCU（或C或A或G）UGG
AAA（或G）AUG
UUU（或C）
脱氧核苷酸序列：
CGA（或G或T或C）
ACC
TTT（或C）TAC
AAA（或G）
（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
1.蛋白质工程的类型
大隐隐于朝
中隐隐于市
小隐隐于野
1.蛋白质工程的类型
以据氨基酸的性质和特点，制造全新蛋白质
改变蛋白质分子中某一个多肽链片段或一个特定的结构
利用基因工程中的定点诱变技术，改造蛋白质分子某活性部位的一个或几个氨基酸残基
2.根据基因工程的原理进行蛋白质的设计和改造
（1）对蛋白质的结构进行设计和改造，最终是通过改造基因来实现的。
（2）改造基因的方法：定点突（诱）变、基因融合和基因拼接。
3.蛋白质工程可以改变蛋白质的性状和功能
（1）提高蛋白质的热稳定性
第3位上的
异亮氨酸
半胱氨酸
-s-s-
定点突变
（2）改变蛋白质的活性，延长作用时间
【材料1】组织纤溶酶原激活物(t-PA)专一激活人体内的纤溶系统，保证血液循环的畅通。但
t-PA用于溶栓治疗时具有一定的局限性，它进入血浆后大部分与纤溶酶原激活剂抑制物
形成复合物，并迅速失去活性。利用蛋白质工程技术对t-PA进行改造，就可以消除上述缺点，
从而增加溶栓效能，减少药用剂量并降低副作用。
【材料2】延长白细胞介素-2的作用时间白细胞介素-2(IL-2)是一种细胞因子，能够促进T淋巴细胞增殖以及增强某些免疫细胞的活性，已被广泛运用于各种肿瘤和病毒感染疾病的治疗。IL-2作为临床药物在血浆中的作用时间较短，治疗期间需要频繁给药。科学家通过蛋白质工程，将长效人血清白蛋白（HSA)与IL-2重组，获得了一种新的融合蛋白（HSA/IL-2),这种融合蛋白既具有普通IL-2的生物活性，作用时间又有所延长，可明显提高IL-2的疗效。
基因拼接
定点突（诱）变
（3）提高蛋白质的效能
胰岛素（如图)制剂现已广泛应用于临床，用于治疗糖尿病。但是天然胰岛素制剂在储存中容易形成二聚体和六聚体，增加了胰岛素从注射部位进入血液的时间，从而延缓了胰岛素制剂的降血糖作用，也增加了抗原性，降低了药效。研究表明，这是由于胰岛素β肽链上的第23和第28个氨基酸的结构造成的（北师大版）。（苏教版：将胰岛素B链由第28位的脯氨酸、第29位的赖氨酸改为第28位的赖氨酸脯氨酸、第29位的脯氨酸）。可避免胰岛素分子形成聚合体，以保证其效能的及时发挥。
定点突（诱）变
（4）合成嵌合抗体
小鼠单克隆抗体的制备比较简单，但这种
鼠源性的单克隆抗体会被人的免疫系统排斥，
不能直接用于人体。嵌合抗体（chimeric
antibody）就是保留鼠单克隆抗体的可变区，而
用人抗体的恒定区替换鼠单克隆抗体的恒定区，
这种嵌合抗体的抗原性显著下降，而抗体的特
异识别功能没有丧失（图1-1-22）。目前，已有多种嵌合抗体用于临床治疗。
基因融合
蛋白质的一级结构：氨基酸排列顺序
蛋白质的二级结构：指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式
蛋白质的三级结构：蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象
蛋白质的四级结构：在体内有许多蛋白质含有2条或2条以上多肽链,才能全面地执行功能。每一条多肽链都有其完完整的三级结构,称为亚基
项目
基因工程
蛋白质工程
区
别
过程
结果
联系
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测相应核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程二者都是通过基因表达产生特定的蛋白质。
获取目的基因的方法：
化学方法人工合成，DNA合成仪
1.研究蛋白质工程，有成功的例子吗？
有，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效性药品。
2.研究蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多，为什么？
主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，这种高级结构十分复杂，而目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还很不够，要设计出更加符合人类需要的蛋白质还需经过艰辛的探索。
3.蛋白质工程的前景如何？
生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。
P29----2.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？
答：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。
P28---3你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？
酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。
通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，
而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
欢迎大家的指点
谢谢欣赏
Annual
Work
Summary
