1.2基因工程的基本操作程序(共51张PPT)
文档属性
| 名称 | 1.2基因工程的基本操作程序(共51张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 2.5MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2021-04-21 23:55:15 | ||
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文档简介
专题一 基因工程
1.2 基因工程的基本操作程序
引入：基因工程培育抗虫棉的简要过程：
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
（一）目的基因：主要是______________________，也可以是一些具有调控作用的因子
编码蛋白质的结构基因
（二）获取目的基因的常用方法
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
例如：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、植物抗病基因等
一、目的基因的获取
未知序列
已知序列
（1）基因文库概念
（2）基因文库类型
基因组文库
部分基因文库
（包含一种生物的所有基因）
（包含一种生物的一部分基因）
（cDNA文库）
（未知序列）
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库
1、从基因文库中获取目的基因
基因组文库
cDNA文库
与载体连接
导入受体菌群
与载体连接
导入受体菌群
用适当
限制酶切割
①基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
许 多
DNA片段
该生物的
基因组文库
②cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
mRNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
(cDNA)
该生物的
cDNA文库
（3）基因文库的构建
1、从基因文库中获取目的基因
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
前体mRNA
成熟mRNA
相应酶去除内含子
转录
逆转录酶
不含内含子的双链cDNA
DNA聚合酶
原核细胞中有没有？
编码区（外显子+内含子）
单链互补DNA
思考：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，从基因组文库还是从cDNA文库中获取目的基因？
基因组文库和cDNA文库的比较
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
村长, 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？？？
当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全不知道目的基因序列，或者想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在不同的发育阶段都表达哪些基因，或者想得到一种生物的全部基因序列，往往就需要构建基因文库。
基因文库构建好了，怎么从中得到我们所需的目的基因呢？？？
目前来说，这还是一件比较复杂的。事情，简单的说就是根据目的基因的相关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因
1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的
A、染色体DNA?? B、线粒体DNA
C、总mRNA?? D、tRNA
2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是
A、某生物的全套基因就是一个基因文库
B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库
C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库
D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库
A
C
当堂训练
2、利用PCR技术扩增目的基因
PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，这一技术不仅可以用于扩增目的基因，在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用。
PCR仪
1、概念：PCR全称为________________，是一项在生物
____复制_____________的核酸合成技术
3、条件：
2、原理：
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
模板
原料：脱氧核苷酸
引物（一小段单链DNA）
热稳定DNA聚合酶（ Taq酶）
4、操作前提：
已知一段目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。
能量
酶：
2、利用PCR技术扩增目的基因
什么是“引物”，为什么需要“引物”？
DNA复制时，子链只能从5'→3'方向延伸，原因是因为DNA聚合酶只能从DNA的3'端开始延伸DNA链、并不能从头合成DNA。
所以需要引物先结合上去，提供3'端。
5、过程：
变性、复性、延伸三步曲
延伸：加热至70～75℃
Taq酶以目的基因为模板，从引物开始，合成互补的新DNA链
变性
复性
延伸
变性：加热至90～95℃
双链DNA解链成为单链DNA
复性：冷却至55～60℃
引物结合到互补的DNA链上
2、利用PCR技术扩增目的基因
5、过程：
变性、复性、延伸三步曲
以_____方式扩增，
即____（n为扩增循环的次数）
指数
2n
6、扩增形式:
在短时间内大量扩增目的基因
7、扩增结果:
2、利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原理
原料
条件
不同点
解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
蛋白质的
氨基酸顺序
mRNA
核苷酸序列
基因的核苷酸序列
目的
基因
推测
DNA合成仪
推测
合成
3、通过DNA合成仪用化学方法人工合成
（序列已知）
1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知
2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
3、过程：
1、若未知目的基因的核苷酸序列，可采用___________________
获取目的基因的三种方法应用
2、若知道目的基因两端的核苷酸序列，且基因比较大，可采用____________
3、若已知目的基因序列，且基因比较小，可采用________________
PCR技术扩增
化学方法人工合成
从基因文库获取的方法
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
—— 核心
为什么要有“表达载体的构建”这一步？
单独的DNA片段─目的基因是不能稳定遗传的。
1.基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代
b、同时使目的基因能表达和发挥作用
二、基因表达载体的构建
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
c、目的基因
b、启动子
d、终止子
e、标记基因
a、复制原点
它们各自有什么作用呢?
二、基因表达载体的构建
核心
2.基因表达载体的组成
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止转录。
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。如：抗四环素基因
标记基因：
有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识目的基因表达的产物存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
2.基因表达载体的构建过程
1.图中切割目的基因和质粒时，用的是同一种限制酶，目的？
2.上述重组质粒的构建中，需要什么酶？
3.为什么目的基因和载体能够组合成一个DNA分子？
4.载体于表达载体有什么不同？
5.能否将目的基因插入载体的标记基因中？
质粒
DNA分子
限制酶切割
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶连接
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
2.基因表达载体的构建过程
DNA连接酶连接后的结果可能是：
①质粒自身环化
②目的基因自身环化
③目的基因与质粒连接形成重组质粒
导入受体细胞后的结果可能是：
①自身环化的质粒
②自身环化的目的基因
③目的基因与质粒连接形成重组质粒
④什么都没导入
抗四环素
基因
抗氨苄青霉
素基因
外源基因
Amp
Tet
Amp
Amp
Tet
Tet
重组DNA
空载体
不含有载体或重组DNA
氨苄青霉
素抗性基因
（amp）
四环素
抗性基因
（tet）
问题：怎样解决质粒自身环化的问题？
√
粘性末端
平末端
用两种限制酶来切割质粒和目的基因
问题：怎样解决质粒自身环化的问题？
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程，称为
受体细胞
稳定
表达
转化
方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
三、将目的基因导入受体细胞
1、农杆菌转化法
农杆菌是一种生活在土壤中的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可以转移到受体细胞的DNA上，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
1、农杆菌转化法
2、基因枪法
单子叶植物常用的基因转化的方法，但成本较高。
又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
3、花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
我国科学家独创的方法，十分简便经济，我国的转基因抗虫棉就是采用的此方法。
适用于被子植物
胚珠
花药
花丝
柱头
花柱
子房壁
子房
雄蕊
雌蕊
4、显微注射法
是目前最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法
原因：①个体大，易操作。
②受精卵全能性高，易培养成完整个体
操作程序:
提纯含目的基因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫
受精卵发育
新性状动物
感受态细胞
用Ca+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态，这种细胞称为感受态细胞
基因工程用微生物作受体细胞的优点：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
5、Ca2+处理
受体生物
植物
动物
微生物
受体细胞
导入方法
受精卵/体细胞
受精卵
细胞/个体
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
显微注
射技术
用Ca2+处理成感受态细胞
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（ ）
A.将毒素蛋白注射到受精卵中
B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉
的体细胞，再进行组织培养
C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精
卵
D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
BC
当堂训练
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
DNA分子导入受体细胞后就说明成功了吗？
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
检测
①导入检测：目的基因是否导入受体细胞
方法——
DNA分子杂交
②表达检测
转录检测——分子杂交
翻译检测——抗原抗体杂交
分子水平检测
鉴定
抗虫鉴定
抗病鉴定
活性鉴定等
个体水平的鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
1、检测——分子水平的检测
转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了
目的基因
基因探针：
指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子
方法——
DNA分子杂交技术
变性
变性
变性
方法——
分子杂交技术
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
1、检测——分子水平的检测
提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
1、检测——分子水平的检测
怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？
没有抗虫基因
的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
2、鉴定——个体水平的鉴定
鉴定——
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子水平检测
第一步
目的基因是否导入受体细胞
DNA分子杂交技术
（DNA和DNA之间）
是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRNA
分子杂交技术
（DNA和mRNA之间）
是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
是否成功显示出杂交带
个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；
基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。
课堂小结
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）、感受态细胞转化法（微生物）
目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
1、下列属于获取目的基因的方法的是( )
①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取
④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成
A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥
D
当堂训练
2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）
A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达
C
3、(山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
基因枪法（花粉管通道法）
植物组织培养
脱分化和再分化
耐盐基因
一定浓度盐水浇灌
当堂训练
1.2 基因工程的基本操作程序
引入：基因工程培育抗虫棉的简要过程：
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
（一）目的基因：主要是______________________，也可以是一些具有调控作用的因子
编码蛋白质的结构基因
（二）获取目的基因的常用方法
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
例如：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、植物抗病基因等
一、目的基因的获取
未知序列
已知序列
（1）基因文库概念
（2）基因文库类型
基因组文库
部分基因文库
（包含一种生物的所有基因）
（包含一种生物的一部分基因）
（cDNA文库）
（未知序列）
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库
1、从基因文库中获取目的基因
基因组文库
cDNA文库
与载体连接
导入受体菌群
与载体连接
导入受体菌群
用适当
限制酶切割
①基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
许 多
DNA片段
该生物的
基因组文库
②cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
mRNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
(cDNA)
该生物的
cDNA文库
（3）基因文库的构建
1、从基因文库中获取目的基因
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
前体mRNA
成熟mRNA
相应酶去除内含子
转录
逆转录酶
不含内含子的双链cDNA
DNA聚合酶
原核细胞中有没有？
编码区（外显子+内含子）
单链互补DNA
思考：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，从基因组文库还是从cDNA文库中获取目的基因？
基因组文库和cDNA文库的比较
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
村长, 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？？？
当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全不知道目的基因序列，或者想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在不同的发育阶段都表达哪些基因，或者想得到一种生物的全部基因序列，往往就需要构建基因文库。
基因文库构建好了，怎么从中得到我们所需的目的基因呢？？？
目前来说，这还是一件比较复杂的。事情，简单的说就是根据目的基因的相关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因
1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的
A、染色体DNA?? B、线粒体DNA
C、总mRNA?? D、tRNA
2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是
A、某生物的全套基因就是一个基因文库
B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库
C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库
D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库
A
C
当堂训练
2、利用PCR技术扩增目的基因
PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，这一技术不仅可以用于扩增目的基因，在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用。
PCR仪
1、概念：PCR全称为________________，是一项在生物
____复制_____________的核酸合成技术
3、条件：
2、原理：
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
模板
原料：脱氧核苷酸
引物（一小段单链DNA）
热稳定DNA聚合酶（ Taq酶）
4、操作前提：
已知一段目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。
能量
酶：
2、利用PCR技术扩增目的基因
什么是“引物”，为什么需要“引物”？
DNA复制时，子链只能从5'→3'方向延伸，原因是因为DNA聚合酶只能从DNA的3'端开始延伸DNA链、并不能从头合成DNA。
所以需要引物先结合上去，提供3'端。
5、过程：
变性、复性、延伸三步曲
延伸：加热至70～75℃
Taq酶以目的基因为模板，从引物开始，合成互补的新DNA链
变性
复性
延伸
变性：加热至90～95℃
双链DNA解链成为单链DNA
复性：冷却至55～60℃
引物结合到互补的DNA链上
2、利用PCR技术扩增目的基因
5、过程：
变性、复性、延伸三步曲
以_____方式扩增，
即____（n为扩增循环的次数）
指数
2n
6、扩增形式:
在短时间内大量扩增目的基因
7、扩增结果:
2、利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原理
原料
条件
不同点
解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
蛋白质的
氨基酸顺序
mRNA
核苷酸序列
基因的核苷酸序列
目的
基因
推测
DNA合成仪
推测
合成
3、通过DNA合成仪用化学方法人工合成
（序列已知）
1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知
2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
3、过程：
1、若未知目的基因的核苷酸序列，可采用___________________
获取目的基因的三种方法应用
2、若知道目的基因两端的核苷酸序列，且基因比较大，可采用____________
3、若已知目的基因序列，且基因比较小，可采用________________
PCR技术扩增
化学方法人工合成
从基因文库获取的方法
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
—— 核心
为什么要有“表达载体的构建”这一步？
单独的DNA片段─目的基因是不能稳定遗传的。
1.基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代
b、同时使目的基因能表达和发挥作用
二、基因表达载体的构建
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
c、目的基因
b、启动子
d、终止子
e、标记基因
a、复制原点
它们各自有什么作用呢?
二、基因表达载体的构建
核心
2.基因表达载体的组成
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止转录。
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。如：抗四环素基因
标记基因：
有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识目的基因表达的产物存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
2.基因表达载体的构建过程
1.图中切割目的基因和质粒时，用的是同一种限制酶，目的？
2.上述重组质粒的构建中，需要什么酶？
3.为什么目的基因和载体能够组合成一个DNA分子？
4.载体于表达载体有什么不同？
5.能否将目的基因插入载体的标记基因中？
质粒
DNA分子
限制酶切割
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶连接
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
2.基因表达载体的构建过程
DNA连接酶连接后的结果可能是：
①质粒自身环化
②目的基因自身环化
③目的基因与质粒连接形成重组质粒
导入受体细胞后的结果可能是：
①自身环化的质粒
②自身环化的目的基因
③目的基因与质粒连接形成重组质粒
④什么都没导入
抗四环素
基因
抗氨苄青霉
素基因
外源基因
Amp
Tet
Amp
Amp
Tet
Tet
重组DNA
空载体
不含有载体或重组DNA
氨苄青霉
素抗性基因
（amp）
四环素
抗性基因
（tet）
问题：怎样解决质粒自身环化的问题？
√
粘性末端
平末端
用两种限制酶来切割质粒和目的基因
问题：怎样解决质粒自身环化的问题？
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程，称为
受体细胞
稳定
表达
转化
方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
三、将目的基因导入受体细胞
1、农杆菌转化法
农杆菌是一种生活在土壤中的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可以转移到受体细胞的DNA上，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
1、农杆菌转化法
2、基因枪法
单子叶植物常用的基因转化的方法，但成本较高。
又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
3、花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
我国科学家独创的方法，十分简便经济，我国的转基因抗虫棉就是采用的此方法。
适用于被子植物
胚珠
花药
花丝
柱头
花柱
子房壁
子房
雄蕊
雌蕊
4、显微注射法
是目前最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法
原因：①个体大，易操作。
②受精卵全能性高，易培养成完整个体
操作程序:
提纯含目的基因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫
受精卵发育
新性状动物
感受态细胞
用Ca+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态，这种细胞称为感受态细胞
基因工程用微生物作受体细胞的优点：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
5、Ca2+处理
受体生物
植物
动物
微生物
受体细胞
导入方法
受精卵/体细胞
受精卵
细胞/个体
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
显微注
射技术
用Ca2+处理成感受态细胞
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（ ）
A.将毒素蛋白注射到受精卵中
B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉
的体细胞，再进行组织培养
C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精
卵
D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
BC
当堂训练
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
DNA分子导入受体细胞后就说明成功了吗？
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
检测
①导入检测：目的基因是否导入受体细胞
方法——
DNA分子杂交
②表达检测
转录检测——分子杂交
翻译检测——抗原抗体杂交
分子水平检测
鉴定
抗虫鉴定
抗病鉴定
活性鉴定等
个体水平的鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
1、检测——分子水平的检测
转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了
目的基因
基因探针：
指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子
方法——
DNA分子杂交技术
变性
变性
变性
方法——
分子杂交技术
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
1、检测——分子水平的检测
提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
1、检测——分子水平的检测
怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？
没有抗虫基因
的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
2、鉴定——个体水平的鉴定
鉴定——
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子水平检测
第一步
目的基因是否导入受体细胞
DNA分子杂交技术
（DNA和DNA之间）
是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRNA
分子杂交技术
（DNA和mRNA之间）
是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
是否成功显示出杂交带
个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；
基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。
课堂小结
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）、感受态细胞转化法（微生物）
目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
1、下列属于获取目的基因的方法的是( )
①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取
④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成
A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥
D
当堂训练
2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）
A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达
C
3、(山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
基因枪法（花粉管通道法）
植物组织培养
脱分化和再分化
耐盐基因
一定浓度盐水浇灌
当堂训练