5.3血红蛋白的提取和分离 教案2020-2021学年高二生物人教版选修一

专题5.3 血红蛋白的提取和分离
教学目标：
1、了解提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性
2、理解色谱法分离蛋白质的基本原理和用途
3、理解缓冲溶液的作用机理和组成、作用，熟悉其配置方法
4、了解电泳法等分离生物大分子的基本原理和种类
教学重点：
1、凝胶色谱法的原理和方法
2、缓冲溶液的作用机理和组成、作用
教学难点：
凝胶色谱法分离蛋白质
课时安排：
1课时
教学过程：
一、引入新课
师：在上一节课我们已经学习完了果胶酶在果汁生产中的应用相关内容，通过学习我们了解到果胶酶能把果胶分解成半乳糖醛酸，那果胶酶的本质是什么？通常得到果胶酶的方法有提取法、发酵法、化学合成。那我们可以怎样提取果胶酶这种蛋白质的？
这就涉及到新的生物学技术，蛋白质技术。
从这一节课开始，我们将进入到第五章，DNA和蛋白质技术，根据安排，我们主要学习蛋白质技术。这就是第五章第三个课题：血红蛋白的提取和分离
播放幻灯片：第二张
师：蛋白质技术作为遗传学、生物学、医学研究的重要手段，是非常重要的，为了更好的学习蛋白质技术，我们先了解一下蛋白质研究的最新国际动态：
播放幻灯片：蛋白质研究最新进展
1、转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白
由武汉大学生命科学院教授、武汉禾元生物科技研发团队进行的植物源替代血浆来源的医药蛋白的研究与开发，现已取得突破性进展并已跨入规模化生产的阶段，填补了国际上此项技术空白。该研究表明由转基因水稻种子生产的重组人血清白蛋白在生理生化性质、物理结构，生物学功能、免疫原性与血浆来源的人血清白蛋白一致；并建立了大规模生产重组人血清白蛋白的生产工艺，获得了高纯度和高产量重组人血清白蛋白产品。正如PNAS 审稿人对该文章的评价：“这篇文章解决了在科学上振奋人心、在经济上都非常重要的议题——即用转基因植物生产血浆产品或其他蛋白产品的技术平台，可代替其他基于发酵的表达技术，其重要性也不言而喻……”
目前，人血清白蛋白广泛应用于临床治疗和细胞培养领域。常见的人血清白蛋白大多数从人的血浆中提取。尽管人血清白蛋白市场广阔，但（提取）高纯度重组人血白蛋白的规模化生产技术和质量控制技术却是世界性难题。武汉禾元历经多年的技术攻关，利用水稻胚乳表达技术平台，研发出国际先进水平的重组人血白蛋白产品生产技术，成功实现重组人血白蛋白规模化和产业化，必将缓解我国人血清白蛋白日益紧张的局面。 （来自2011年10月31日pans）
师：怎么样提取蛋白质？为什么提取高纯度蛋白质是世界性难题？
2、确定 “疼痛接触” 的蛋白质
在2月19日的Nature上发表了两篇具有里程碑意义的文章，斯克里普斯研究所的科学家报道他们已鉴定了能检测“疼痛接触”的一类蛋白质。
已知我们皮肤里的感觉神经能通过外层膜里某些专门蛋白来检测压力、疼痛、热、冷和其他他刺激。但是他们也只是刚开始鉴定和特征化参与每一种感觉传导通路的专门蛋白。新研究中的实验在哺乳动物感觉神经系统的模型系统果蝇中开展，压力蛋白也在果蝇中表达，以及耳、肾、心和其他组织内的某些类型细胞中表达。将来的研究将集中于压力蛋白在传感声音、血压及压或拉伸细胞膜的相关刺激中的作用。（来源于2012年2月19日nature ）
师：“已鉴定这类蛋白质”，可以通过什么途径鉴定这类蛋白质？ 你能想到什么办法可以鉴定蛋白质？
抽问学生：
学生：双缩脲试剂（紫色）、（化学上提过浓硝酸变黄色）
师：对，我们可以通过双缩脲试剂鉴定蛋白质，但是如果我们要鉴定蛋白质的分子大小，性状，还能用这个方法吗？
现在摆在我们面前有2个问题，一是如何提取蛋白质？如何用其他方法鉴定蛋白质？为了更好的思考这个问题，我们先回忆必修中蛋白质相关知识，争取在从这里面寻找到我们的钥匙：
二、蛋白质基础知识
师1：蛋白质的基本单位是氨基酸
板书：
师2、氨基酸的结构通式？
学生回答：在同一个C原子上同时连接着一个R基、氢基、氨基、羧基
板书：
师3、连接两个氨基酸分子的化学键是什么？
抽问学生：
板书：
师4、蛋白质的功能？蛋白质种类多样性的原因？
抽问学生：
学生回答：构成细胞生物体的基本结构如指甲，催化各种反应如酶，运输载体如血红蛋白，参与免疫如抗体，信息传递，调节生命活动，如胰岛素。因为构成不同蛋白质的氨基酸种类、排列顺序不同，而且不同蛋白质的空间结构不同，造成了蛋白质的多样。
板书：
播放幻灯片：不同的蛋白质图片
师：除此以外，生物体内的蛋白质存在分子量、电荷、溶解度、吸附性质、和对其他分子的亲和力等等也有差异，科学家根据这些差异性，就发明了不同的方法提取分离蛋白质，下面我们就一起学习一下：
播放幻灯片：
（一）凝胶色谱法（分配色谱法）
师：原理：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
其中的凝胶是指：一些微小的多孔球体，这些球体大多是由多糖类化合物构成的，在这些小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶的路程不同，而对蛋白质进行分离。
常见的凝胶有：交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
播放幻灯片图片并解释：图5-13
播放动画凝胶色谱法动画
提问学生：通过动画，你能看出大分子和小分子的路径差异吗？
师总结：从动画中我们可以看到，相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。分子量介于二者之间的物质，虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的速度比小分子快，而比大分子慢。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
师：我们看一下实验室的模式图和实际操作图。
播放幻灯片：
师：从这个图片中，我们看到，在实验中，我们还需要一直用缓冲液对蛋白质进行处理，那是为什么啊？
师提示：在本课题中我们研究的血红蛋白的提取，血红蛋白存在位置在哪？红细胞生活的内环境是？
学生统一回答：存在于红细胞中，血浆
师：那同学们想想内环境如何位置其理化性质PH的稳定？
学生：缓冲液
师：下面我们就学习一下缓冲溶液的知识：
播放幻灯片：
（二）缓冲液
师：定义：能抵抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释，而能保持其pH基本不变的作用叫缓冲作用，像这样的溶液称为缓冲溶液
师：你能说出维持内环境ph稳定的缓冲液吗？
生：H2CO3—NaHCO3 NaH2PO4—Na2HPO4
师：组成：缓冲液由足够的共轭酸碱对组成，其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸，能对抗外来强酸的为共轭碱。这一对共轭酸碱通常称为缓冲液。常见主要有三类：
播放幻灯片：
1、弱酸及其对应的盐：如H2CO3—NaHCO3
2、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐：如：NaHCo3—Na2Co3；NaH2PO4—Na2HPO4
3、弱碱及其对应的盐：如NH3·Ｈ２Ｏ—NH4Cl
师：缓冲液的原理是怎样的？
幻灯片：
原理：以NaHCo3—Na2CO3为例。当有少量酸进入时，CO3 + H+ ? HCO3
当有少量碱进入时，OH +HCO3?H2O+CO32-
作用：维持反应体系的PH值相对稳定，为生化反应提供适宜的酸碱环境其实，让血红蛋白处在稳定的pH范围内（模拟细胞内ph值），维持结构和功能。
师：你能联想到生活中的缓冲作用吗？如运动鞋鞋底设计就具有缓冲功能，汽车车轴上面的缓冲，在生物体内也有缓冲。
师：除了凝胶色谱法分离蛋白质外，我们还可以通过电泳的方法对蛋白质进分离。
播放幻灯片：
（三）电泳
师：定义：指带点粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
师：原理：蛋白质、核酸分子的一些基团在一定的pH下会发生水解或电离从而带有电荷，在电场的作用下，带电的分子会向着所带电荷相反的方向移动。由于样品中各种分子净电荷的量的差异以及分子本身的大小等因素，使有机分子产生不同的迁移速率，从而将样品中各种有机分子分离开。
常见电泳：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
师：简单介绍电泳仪
师：还有第三种比较重要的电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在电泳时在蛋白质样品中加入SDS（十二烷基硫酸钠）进行处理， SDS能使蛋白质变性，并与各种蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS本身带有的电量大大超过了蛋白质的电量，可以掩盖了蛋白质的电荷差别，使电泳的移动率完全取决于分子的大小。
师问：如果要分别检测检测某样品的带电荷量和分子量，你选择怎样的电泳？
学生：电荷可以用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，分子量用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
播放幻灯片：电泳动画：
即在电场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢，离前沿较远，而分子量小的蛋白质迁移快，离前沿较近。这样，不同分子量大小的蛋白质得到了分离。如果蛋白质的纯度高，迁移率一致，就会形成前沿整齐、清晰的条带。
播放幻灯片：电泳区带图片
师：电泳后，我们会得到一个区带，通过与标准区带对比，就能计算出蛋白质的分子质量，并进行其他的分析。
在本课题中我们需要提取分离血红蛋白，血红蛋白存在于红细胞中，为了更好的了解如何得到纯度更高的血红蛋白，我们需要回忆一下血液相关知识：
（四）血液
血液包括血细胞（红细胞、白细胞、血小板）和血浆（其中有蛋白质、脂类、糖类、维生素、激素等等）。红细胞内90%是血红蛋白、其他的有如_???è§?è?¨_、氧气、二氧化碳等。血红蛋白是使血液呈红色的蛋白，血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子的氧和一分子的二氧化碳，血红蛋白因为血红素而呈现红色。
现在我们已经知道血红蛋白存在红细胞内，但是红细胞有细胞膜会阻止血红蛋白的渗出，那通过什么方法可以得到血红蛋白？
这就涉及到实验的具体操作，下面简单的介绍一下实验操作的步骤：
蛋白质提取分离的步骤一般分为四个：样品处理（就是得到血红蛋白）、粗分离（通过透析（渗透作用原理）分离小分子杂质）、纯化（凝胶色谱柱法）、纯度鉴定（电泳）
对于如何制备得到样品，如何进行凝胶色谱过滤，我们在下一节课中将继续学习。
现在我们总结一下这节课的主要内容：
一是蛋白质的基础知识，二是提取、分离蛋白质的方法，这些方法也可以用在分离核酸等物质。
下面我们做几道题目检测一下：
1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）
A. 相对分子质量大的
B. 溶解度高的
C. 相对分子量小的
D. 所代电荷多的
答案：A
2 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）
A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快
答案：D
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少 B 分子的大小
C 肽链的多少 D 分子形状的差异
答案：B
4 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）
A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
答案：c