基因工程的基本操作程序
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文档简介
(共77张PPT)
1.2 基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
基因工程基本操作的四个步骤
一.目的基因的获取
1.基因的结构
2.目的基因的概念
3.目的基因的获取的方法
(与RNA聚合酶结合位点、启动转录)
启动子
(转录终止标记)
终止子
原核细胞的基因结构
转录RNA
(编码序列)
调控遗传信息的表达
(调控序列)
编码区
非编码区
(下游)
非编码区
（上游）
编码区
非编码区
非编码区
外显子
(能编码蛋白质)
启动子
内含子
(不能编码蛋白质)
真核细胞的基因结构
上游
终止子
下游
(与RNA聚合酶结合位点)
(转录终止标记)
调控遗传信息的表达
(调控序列)
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是
_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
连续
不连续
编码区
非编码
编码区
非编码区
非编码区
启动子
终止子
ATGTGCACGTAGTTA
TACACGTGCATCAAT
RNA聚合酶
AUGUGCACGUAGUUA
DNA(基因)
启动/终止转录
mRNA
起始/终止翻译
mRNA中存在启动子/终止子的序列吗？
启动子 起始密码子
/终止子 终止密码子
存在部位：
作用：
外显子
内含子
外显子
外显子
内含子
真核细胞的基因
①在细胞核内转录
RNA
②在核内内含子被切去，外显子彼此连接
mRNA
原核细胞的基因
①在细胞质内转录
真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNA前体，
需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
3.目的基因的获取的方法
（3）用化学方法直接人工合成目的基因
（1）从基因文库中获取目的基因
（2）利用PCR技术扩增目的基因
2.目的基因的概念
主要是指编码蛋白质基因
也可以是一些具有调控作用的因子
注意：要保持基因的完整性
(1) 从基因文库中获取目的基因
1）.基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
基因组文库的建立方法
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与运载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
方法：直接分离法(鸟枪法)
优缺点：操作简单、工作量大、盲目性强
适用生物：原核生物、病毒等（真核生物一般不用此方法）
酶：限制性内切酶、DNA连接酶
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
单链DNA
双链cDNA片段
重组载体
与载体连接（DNA连接酶）
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
② cDNA文库的构建-----逆转录法：
mRNA
单链DNA
双链DNA
（cDNA）
特点：获取的DNA片段是具有特定功能的目的基因，且不含内含子和非编码区（启动子和终止子）
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制酶
与运载体连接导入
基因组文库
cDNA
反转录
受体菌群体
与运载体连接导入
部分基因文库
（cDNA文库）
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
某种生物某个时期的mRNA
1) 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
2) 原理：
DNA复制
2、利用PCR技术扩增目的基因
四种脱氧核苷酸
一对引物：
热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
模板DNA( 需含有目的基因 )、
3) PCR进行的条件：
一对脱氧核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物
4) PCR进行的前提：
5）过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
d、重复
具体过程
PCR(多聚酶链式反应)
6) 方式：以_____方式扩增，即____
7) 结果：
短时间内大量扩增目的基因
指数
2n
8）仪器：
PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）
5) 过程
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
(不需要解旋酶)
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
反转录法
目的基因的信使RNA
目的基因
化学合成法
肽链氨基酸序列
信使RNA序列
基因的核苷酸序列
目的基因
合成
3.人工合成法（一般用于真核生物）
推测
推测
单链DNA
合成
不具有完整基因结构，缺少非编码区(启动子、终止子），非编码序列（如内含子），要人工构建。
一、目的基因的获取
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
课堂小结：
---有一段已知目的基因的核苷酸序列
——已知目的基因的核苷酸序列，比较小
——不知道目的基因核苷酸序列
1.作用：
二. 基因表达载体的构建——核心
IMN
2.组成：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。
②同时使目的基因能表达和发挥作用。
(3)终止子：
(4)标记基因：
(2)启动子：
(1)目的基因。
（5）复制原点：
-----载体构建组成要完整
(1 目的基因)
(4标记基因)
2
3
5
Hin d限制性酶ⅠⅡ
Hin dIII
Hin dIII
目的DNA
质粒
构建表达载体
四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因
DNA连接酶
人类胰岛素的基因
抗青
抗四
抗青
用含氨苄青霉素培养所有的大肠杆菌
不存活：导入质粒失败
存活
导入含有目的基因质粒的大肠杆菌
导入不含目的基因质粒的大肠杆菌
含四环素的培养基筛选
（导入成功）
不存活
存活
导入
接种培养
接种培养
接种培养
接种培养
含有氨苄青霉素的完全培养基
完全培养基
大肠杆菌不含抗氨苄青霉素基因
证明：
不存活
含有氨苄青霉素的完全培养基
证明：
大肠杆菌含抗氨苄青霉素基因
证明：
大肠杆菌的受体细胞含有目的基因
氨苄青霉素抗性基因
氨苄青霉素抗性基因
完全培养基
存活
如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？
培养
检测含重组质粒的大肠杆菌
含有氨苄青霉素 的完全培养基
含有四环素的完全培养基
（大肠杆菌内含有氨苄青霉素抗性基因，不含有四环素抗性基因）
只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌
不存活
存活
证明：目的基因已导入大肠杆菌
培养
培养
完全培养基
培育出得到能够发酵产生人类胰岛素的工程菌。
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②启动子、终止子对于目的基因表达必不可少③目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
④用到的工具酶：限制酶,DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
注意
常用的受体细胞：
植物细胞、动物细胞、
微生物细胞：酵母菌、大肠杆菌、土壤农杆菌
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1.转化：
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
三、将目的基因导入受体细胞
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
特点:
能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上
转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
整合
植物细胞染色体DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
（2）基因枪法——微弹轰击法
特点：成本高
适用于单子叶植物
（3）花粉管通道法
适用于被子植物
特点：
十分简便经济
①受体细胞：
②操作程序：
___显微注射法：
（2）将目的基因导入动物细胞
发育成新性状动物
移植到子宫或输卵管
培养成早期胚胎
显微注射
取受精卵
提纯含目的基因表达载体
受精卵（具有全能性）
③常用法：
②常用菌：
①原核生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
④过程：
大肠杆菌
Ca2+处理获得感受态细胞
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态
细胞
表达载体
与感受态
细胞混合
感受态细胞
吸收DNA
（3）将目的基因导入微生物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程
2.常见转化方法：
（3）将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法。
①农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。
（1）将目的基因导入植物细胞
③基因枪法：单子叶植物。
②花粉管通道法：被子植物。
显微注射法。
（2）将目的基因导入动物细胞：
四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
1.检测－－分子水平检测
转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
14N
14N
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了
目的基因
基因探针：
放射性同位素等标记的DNA分子
方法——
DNA分子杂交技术
变性
变性
DNA—DNA杂交链
变性
方法——
DNA分子杂交技术
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
14N
14N
DNA—RNA杂交链
提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白基因
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样
BT毒性蛋白
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
2.鉴定——个体生物学水平的鉴定
（1）多细胞个体
抗虫、抗病接种实验，活性比较实验
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。保留有表达产物的进一步培养、研究。
（2）单细胞生物
抗虫鉴定 抗病鉴定
活性鉴定等
抗原－抗体杂交法
DNA-RNA分子杂交法
DNA分子杂交法
受体是否具有
转基因特征
个体水平
目的基因是否翻译
目的基因是否转录
目的基因是否导入
分子水平
方法
检测对象
四 目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
1.2基因工程的基本操作程序
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
Hin d限制性酶ⅠⅡ
Hin dIII
Hin dIII
目的DNA
土壤农杆菌Ti质粒
苏云金芽孢杆菌
一、获取目的基因
Bt毒素蛋白基因
苏云金杆菌
DNA连接酶
T-DNA
(可转移-DNA)
二、构建表达载体
导入
三、含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌
Ca2+ 处理农杆菌获得感受态细胞
检测
农杆菌
具有抗氨苄青霉素基因的农杆菌
农杆菌
含有氨苄青霉素 的完全培养基
农杆菌
证明：目的基因已导入
存活
无抗氨苄青霉素基因的农杆菌
脱分化
农杆菌
四、导入植物细胞－－检测与鉴定
再分化
移植
个体生物学水平的鉴定
如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达
侵染植物细胞
组织培养
11、基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。根据图示,判断下列操作正确的是( )
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
20、现有一长度为1000碱基对(by）的DNA分子，用限制性核酸内切酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000 by，用Kpn1单独酶切得到400 by和600 by两种长度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200 by和600 by两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是（ ）
23．多数真核生物基因中编码蛋白质的序列被一些不编码蛋白质的序列隔开，每一个不编码蛋白质的序列称为一个内含子。这类基因经转录、加工形成的mRNA中只含有编码蛋白质的序列。某同学为检测某基因中是否存在内含子，进行了下面的实验：
步骤①：获取该基因的双链DNA片段及其mRNA；
步骤②：加热DNA双链使之成为单链，并与步骤①所获得的mRNA按照碱基配对原则形成双链分子；
步骤③：制片、染色、电镜观察，可观察到图中结果。
请回答：
（1）图中凸环形成的原因是 ，说明该基因有 个内含子。
（2）如果现将步骤①所获得的mRNA逆转录得到DNA单链，然后该DNA单链与步骤②中的单链DNA之一按照碱基配对原则形成双链分子，理论上也能观察到凸环，其原因是逆转录得到的DNA单链中不含有 序列。
（1）DNA中有内含子序列， mRNA中没有其对应序列，变性后形成的DNA单链之一与mRNA形成双链分子时，该单链DNA中无法与mRNA配对的序列能形成凸环 7
（2）内含子
(2)化学合成法和PCR技术扩增技术
——（目的基因核苷酸序列已知或者部分已知）
1、化学合成法
已知氨基酸序列的蛋白质
mRNA核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
化学合成
注意：当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
2、利用PCR技术扩增目的基因
推测
推测
① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_________________________、
______________ 、 ___________ 、
_______________________
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）
⑤结果：
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
已知基因的核苷酸序列（前提）
四种脱氧核苷酸
一对引物
耐热的DNA聚合酶（Taq酶）
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
PCR技术扩增目的基因技术
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2、表达载体的组成
启动子
终止子
目的基因
标记基因等
它们各自的作用是什么
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
质粒
DNA分子
限制酶处理
二个切口
两个黏性末端
四个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
3.过程:
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
1、将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T--DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程：
④优点
（2）基因枪法
（3）花粉管通道法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少
②方法：
大肠杆菌细胞
用Ca2+处理
感受态细胞
重组表达载体DNA溶于缓冲液
混合
转入
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
（一）、检测
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤)
①.首先取出转基因生物的基因组DNA
②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
（1）方法:
DNA分子杂交
（2）过程:
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
P15思考与探究
（二）、鉴定（个体生物学水平）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①方法:
分 子 杂 交
方法:
抗原抗体杂交
②过程:
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
(分子
水平)
鉴定——
（个体水平）
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原抗体杂交
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
鉴定：
1.2 基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
基因工程基本操作的四个步骤
一.目的基因的获取
1.基因的结构
2.目的基因的概念
3.目的基因的获取的方法
(与RNA聚合酶结合位点、启动转录)
启动子
(转录终止标记)
终止子
原核细胞的基因结构
转录RNA
(编码序列)
调控遗传信息的表达
(调控序列)
编码区
非编码区
(下游)
非编码区
（上游）
编码区
非编码区
非编码区
外显子
(能编码蛋白质)
启动子
内含子
(不能编码蛋白质)
真核细胞的基因结构
上游
终止子
下游
(与RNA聚合酶结合位点)
(转录终止标记)
调控遗传信息的表达
(调控序列)
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是
_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
连续
不连续
编码区
非编码
编码区
非编码区
非编码区
启动子
终止子
ATGTGCACGTAGTTA
TACACGTGCATCAAT
RNA聚合酶
AUGUGCACGUAGUUA
DNA(基因)
启动/终止转录
mRNA
起始/终止翻译
mRNA中存在启动子/终止子的序列吗？
启动子 起始密码子
/终止子 终止密码子
存在部位：
作用：
外显子
内含子
外显子
外显子
内含子
真核细胞的基因
①在细胞核内转录
RNA
②在核内内含子被切去，外显子彼此连接
mRNA
原核细胞的基因
①在细胞质内转录
真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNA前体，
需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
3.目的基因的获取的方法
（3）用化学方法直接人工合成目的基因
（1）从基因文库中获取目的基因
（2）利用PCR技术扩增目的基因
2.目的基因的概念
主要是指编码蛋白质基因
也可以是一些具有调控作用的因子
注意：要保持基因的完整性
(1) 从基因文库中获取目的基因
1）.基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
基因组文库的建立方法
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与运载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
方法：直接分离法(鸟枪法)
优缺点：操作简单、工作量大、盲目性强
适用生物：原核生物、病毒等（真核生物一般不用此方法）
酶：限制性内切酶、DNA连接酶
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
单链DNA
双链cDNA片段
重组载体
与载体连接（DNA连接酶）
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
② cDNA文库的构建-----逆转录法：
mRNA
单链DNA
双链DNA
（cDNA）
特点：获取的DNA片段是具有特定功能的目的基因，且不含内含子和非编码区（启动子和终止子）
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制酶
与运载体连接导入
基因组文库
cDNA
反转录
受体菌群体
与运载体连接导入
部分基因文库
（cDNA文库）
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
某种生物某个时期的mRNA
1) 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
2) 原理：
DNA复制
2、利用PCR技术扩增目的基因
四种脱氧核苷酸
一对引物：
热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
模板DNA( 需含有目的基因 )、
3) PCR进行的条件：
一对脱氧核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物
4) PCR进行的前提：
5）过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
d、重复
具体过程
PCR(多聚酶链式反应)
6) 方式：以_____方式扩增，即____
7) 结果：
短时间内大量扩增目的基因
指数
2n
8）仪器：
PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）
5) 过程
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
(不需要解旋酶)
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
反转录法
目的基因的信使RNA
目的基因
化学合成法
肽链氨基酸序列
信使RNA序列
基因的核苷酸序列
目的基因
合成
3.人工合成法（一般用于真核生物）
推测
推测
单链DNA
合成
不具有完整基因结构，缺少非编码区(启动子、终止子），非编码序列（如内含子），要人工构建。
一、目的基因的获取
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
课堂小结：
---有一段已知目的基因的核苷酸序列
——已知目的基因的核苷酸序列，比较小
——不知道目的基因核苷酸序列
1.作用：
二. 基因表达载体的构建——核心
IMN
2.组成：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。
②同时使目的基因能表达和发挥作用。
(3)终止子：
(4)标记基因：
(2)启动子：
(1)目的基因。
（5）复制原点：
-----载体构建组成要完整
(1 目的基因)
(4标记基因)
2
3
5
Hin d限制性酶ⅠⅡ
Hin dIII
Hin dIII
目的DNA
质粒
构建表达载体
四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因
DNA连接酶
人类胰岛素的基因
抗青
抗四
抗青
用含氨苄青霉素培养所有的大肠杆菌
不存活：导入质粒失败
存活
导入含有目的基因质粒的大肠杆菌
导入不含目的基因质粒的大肠杆菌
含四环素的培养基筛选
（导入成功）
不存活
存活
导入
接种培养
接种培养
接种培养
接种培养
含有氨苄青霉素的完全培养基
完全培养基
大肠杆菌不含抗氨苄青霉素基因
证明：
不存活
含有氨苄青霉素的完全培养基
证明：
大肠杆菌含抗氨苄青霉素基因
证明：
大肠杆菌的受体细胞含有目的基因
氨苄青霉素抗性基因
氨苄青霉素抗性基因
完全培养基
存活
如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？
培养
检测含重组质粒的大肠杆菌
含有氨苄青霉素 的完全培养基
含有四环素的完全培养基
（大肠杆菌内含有氨苄青霉素抗性基因，不含有四环素抗性基因）
只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌
不存活
存活
证明：目的基因已导入大肠杆菌
培养
培养
完全培养基
培育出得到能够发酵产生人类胰岛素的工程菌。
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②启动子、终止子对于目的基因表达必不可少③目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
④用到的工具酶：限制酶,DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
注意
常用的受体细胞：
植物细胞、动物细胞、
微生物细胞：酵母菌、大肠杆菌、土壤农杆菌
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1.转化：
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
三、将目的基因导入受体细胞
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
特点:
能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上
转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
整合
植物细胞染色体DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
（2）基因枪法——微弹轰击法
特点：成本高
适用于单子叶植物
（3）花粉管通道法
适用于被子植物
特点：
十分简便经济
①受体细胞：
②操作程序：
___显微注射法：
（2）将目的基因导入动物细胞
发育成新性状动物
移植到子宫或输卵管
培养成早期胚胎
显微注射
取受精卵
提纯含目的基因表达载体
受精卵（具有全能性）
③常用法：
②常用菌：
①原核生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
④过程：
大肠杆菌
Ca2+处理获得感受态细胞
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态
细胞
表达载体
与感受态
细胞混合
感受态细胞
吸收DNA
（3）将目的基因导入微生物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程
2.常见转化方法：
（3）将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法。
①农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。
（1）将目的基因导入植物细胞
③基因枪法：单子叶植物。
②花粉管通道法：被子植物。
显微注射法。
（2）将目的基因导入动物细胞：
四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
1.检测－－分子水平检测
转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
14N
14N
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了
目的基因
基因探针：
放射性同位素等标记的DNA分子
方法——
DNA分子杂交技术
变性
变性
DNA—DNA杂交链
变性
方法——
DNA分子杂交技术
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
14N
14N
DNA—RNA杂交链
提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白基因
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样
BT毒性蛋白
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
2.鉴定——个体生物学水平的鉴定
（1）多细胞个体
抗虫、抗病接种实验，活性比较实验
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。保留有表达产物的进一步培养、研究。
（2）单细胞生物
抗虫鉴定 抗病鉴定
活性鉴定等
抗原－抗体杂交法
DNA-RNA分子杂交法
DNA分子杂交法
受体是否具有
转基因特征
个体水平
目的基因是否翻译
目的基因是否转录
目的基因是否导入
分子水平
方法
检测对象
四 目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
1.2基因工程的基本操作程序
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
Hin d限制性酶ⅠⅡ
Hin dIII
Hin dIII
目的DNA
土壤农杆菌Ti质粒
苏云金芽孢杆菌
一、获取目的基因
Bt毒素蛋白基因
苏云金杆菌
DNA连接酶
T-DNA
(可转移-DNA)
二、构建表达载体
导入
三、含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌
Ca2+ 处理农杆菌获得感受态细胞
检测
农杆菌
具有抗氨苄青霉素基因的农杆菌
农杆菌
含有氨苄青霉素 的完全培养基
农杆菌
证明：目的基因已导入
存活
无抗氨苄青霉素基因的农杆菌
脱分化
农杆菌
四、导入植物细胞－－检测与鉴定
再分化
移植
个体生物学水平的鉴定
如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达
侵染植物细胞
组织培养
11、基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。根据图示,判断下列操作正确的是( )
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
20、现有一长度为1000碱基对(by）的DNA分子，用限制性核酸内切酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000 by，用Kpn1单独酶切得到400 by和600 by两种长度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200 by和600 by两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是（ ）
23．多数真核生物基因中编码蛋白质的序列被一些不编码蛋白质的序列隔开，每一个不编码蛋白质的序列称为一个内含子。这类基因经转录、加工形成的mRNA中只含有编码蛋白质的序列。某同学为检测某基因中是否存在内含子，进行了下面的实验：
步骤①：获取该基因的双链DNA片段及其mRNA；
步骤②：加热DNA双链使之成为单链，并与步骤①所获得的mRNA按照碱基配对原则形成双链分子；
步骤③：制片、染色、电镜观察，可观察到图中结果。
请回答：
（1）图中凸环形成的原因是 ，说明该基因有 个内含子。
（2）如果现将步骤①所获得的mRNA逆转录得到DNA单链，然后该DNA单链与步骤②中的单链DNA之一按照碱基配对原则形成双链分子，理论上也能观察到凸环，其原因是逆转录得到的DNA单链中不含有 序列。
（1）DNA中有内含子序列， mRNA中没有其对应序列，变性后形成的DNA单链之一与mRNA形成双链分子时，该单链DNA中无法与mRNA配对的序列能形成凸环 7
（2）内含子
(2)化学合成法和PCR技术扩增技术
——（目的基因核苷酸序列已知或者部分已知）
1、化学合成法
已知氨基酸序列的蛋白质
mRNA核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
化学合成
注意：当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
2、利用PCR技术扩增目的基因
推测
推测
① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_________________________、
______________ 、 ___________ 、
_______________________
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）
⑤结果：
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
已知基因的核苷酸序列（前提）
四种脱氧核苷酸
一对引物
耐热的DNA聚合酶（Taq酶）
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
PCR技术扩增目的基因技术
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2、表达载体的组成
启动子
终止子
目的基因
标记基因等
它们各自的作用是什么
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
质粒
DNA分子
限制酶处理
二个切口
两个黏性末端
四个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
3.过程:
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
1、将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T--DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程：
④优点
（2）基因枪法
（3）花粉管通道法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少
②方法：
大肠杆菌细胞
用Ca2+处理
感受态细胞
重组表达载体DNA溶于缓冲液
混合
转入
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
（一）、检测
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤)
①.首先取出转基因生物的基因组DNA
②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
（1）方法:
DNA分子杂交
（2）过程:
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
P15思考与探究
（二）、鉴定（个体生物学水平）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①方法:
分 子 杂 交
方法:
抗原抗体杂交
②过程:
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
(分子
水平)
鉴定——
（个体水平）
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原抗体杂交
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
鉴定：