(共43张PPT)
1.1 DNA重组技术的基本工具
基础理论和技术的发展催生了基因工程
基因工程的别名
操作环境
操作对象
操作水平
实质
结果
DNA重组技术
生物体外
基因
DNA分子水平
人类需要的基因产物
基因重组
基因工程的概念
脱氧核糖
磷酸
脱氧（核糖）核苷酸
含氮碱基
A T G C
DNA的基本单位：
磷酸二酯键
即脱氧核糖、磷酸之间的连接
A
T
G
G
C
A
T
C
T
T
C
G
A
A
G
P
A
P
一、基因的结构
1.原核细胞基因结构
1,包括编码区和非编码区
3,启动子是控制转录的开始，有RNA聚合酶结合的位点
4,当RNA聚合酶移行至终止子时，转录结束
2,非编码区对编码区的转录起调控作用
包括编码区和非编码区（启动子和终止子）
非编码区对编码区的表达起调控作用
编码区是不连续的，包含内含子（非编码序列）和外显子（编码序列）
不同基因编码区所包含的内含子和外显子数目不同。
2.真核细胞基因结构
思考：内含子不含有遗传信息，那么转录的时候内含子上哪儿去了？
内含子
外显子
外显子
内含子
前体mRNA
成熟mRNA
剪切（内含子）
拼接（外显子）
拼接体
蓝色素基因
三色紫罗兰
玫瑰
导入
目的基因
受体细胞
提供的材料
1、一段含有三色紫罗兰蓝色素基因的DNA片段
2、受体细胞-----玫瑰体细胞
要实现三色紫罗兰的蓝色素基因在玫瑰体细胞内表达从而获得相应性状，我们该怎么做呢？
基因工程培育蓝色妖姬的关键步骤：
关键步骤一：
在体外对含有三色紫罗兰蓝色素基因的DNA分子进行切割
关键步骤二：
三色紫罗兰蓝色素基因与质粒连接
关键步骤三：
三色紫罗兰蓝色素基因导入受体(玫瑰）细胞
基因的剪刀——限制酶
基因的针线——DNA连接酶
基因的运载工具——载体
专一性，识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。能将外来的DNA切断。本质是蛋白质
约4000种。
1)来源：
2)种类：
3)作用特点：
1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
二、DNA重组技术的基本工具
T
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
A
磷酸二酯键
限制酶的识别特殊序列
专门识别以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称、重复排列的核苷酸序列
什么叫黏性末端？
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
限制酶
什么叫平末端？
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
专一性，识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。能将外来的DNA切断。本质是蛋白质
约4000种。
1)来源：
2)种类：
3)作用特点：
1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
二、DNA重组技术的基本工具
形成两种末端
黏性末端
平末端
4)结果：
断开磷酸二酯键
限制酶 DNA水解酶
区别
限制性内切酶与DNA水解酶的区别
切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成DNA片段
切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
限制酶酶切
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
不同来源的DNA片段混合
将不同种来源的DNA片段连接起来
生物A基因片段
生物B基因片段
……G AATTC……
……CTTAA G……
……GAATTC……
……CTTAAG……
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC……
……CTTAA G……
同一种
G A A T T C
C T T A A G
G
P
A
P
（2）作用部位：磷酸二酯键
（1）作用：把两条双链 之间的缝隙“缝合”起来。
DNA片段
2. DNA连接酶 ——分子缝合针
用DNA连接酶连接两个互补的黏性末端需要连接几个磷酸二酯键？切下一个特定基因呢？
2个、4个
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
限制酶酶切
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
不同来源的DNA片段混合
（有相同黏性末端）
生物A基因片段
生物B基因片段
……G AATTC……
……CTTAA G……
……GAATTC……
……CTTAAG……
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC……
……CTTAA G……
同一种
连接酶
重组DNA分子
碱基互补配对
（无识别特异性）
不同的DNA被同一种限制酶切割产生的黏性末端相同
不同的限制酶切出的黏性末端，如果碱基可以互补配对，即可被连接酶连接
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·coli DNA连接酶 或T4DNA连接酶
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
T4DNA连接酶
类型
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
（3）分类
2. DNA连接酶 ——分子缝合针
G
C
T
T
A
A
G
C
T
T
A
A
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
DNA聚合酶 DNA连接酶
区别1
区别2
相同点
DNA连接酶与DNA聚合酶比较：
1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键
形成磷酸二酯键
1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链
2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板
外源基因(如蓝色素基因)怎样才能导入受体细胞(如玫瑰细胞)？
导入过程需要运输工具——运载体。
⒈载体需要的条件：
⑴有1~多个限制酶切点
⑵对受体细胞无害
⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达
⑷有某些标记基因，便于筛选
⒉常用运载体：
⑴细菌的质粒
⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒
⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？
⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？
⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？
⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？
3.基因进入受体细胞的运载体——分子运输车
常用的载体：质粒
能复制并带着插入的目的基因一起复制
有切割位点
有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别
——人工改造的
抗Amp
含有Amp的培养基
模拟制作：P7
棉花的 一段DNA
含毒蛋白基因的细菌DNA片段
尝试写出序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端
2
7
4
8
3
6
1
5
思考与探究 P7 （2）
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示：
基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。
是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？
不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
思考与探究 P7
作为运载体必须具备哪些条件？
1）载体DNA必须是安全的。
2）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
3）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。
4）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.
常用的运载体主要有两类：
1）细菌细胞质的质粒
2）噬菌体或某些动植物病毒
3.基因进入受体细胞的运载体——分子运输车
质粒：
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。
有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。
质粒是基因工程最常用的运载体。
质粒的特点
1.细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型闭合环状DNA分子；
2.质粒的存在对宿主细胞无影响；
3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，含有如四环素的标记基因。
1、载体必须具备的条件：
A、具有多个限制酶切点，以便与外源基因插
入其中；
B、具有特殊的遗传标记基因，便于进行筛选。
C、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；
D、对受体细胞无害
（双链DNA分子、载体DNA分子大小应合适等。）
（三）基因进入受体细胞的载体 分子运输车
