微生物的培养与应用

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选修1复习
第 二 讲
微生物的培养与应用
要点归纳
1. 培养基
　(1)种类：按培养基的物理性质分为
　　　①液体培养基：配制成的液体状态的基质，一般用于生产。
　　　②固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂(如琼脂)，配制成固体状态的基质，琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一。　
(2)培养基配方及营养要素
　　 基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
条件 结果 常用的方法
消毒
灭菌
2. 无菌技术
(1)消毒和灭菌的区别
条件 结果 常用的方法
消毒 较为温和的物理或化学方法
灭菌 强烈的理化因素
2. 无菌技术
(1)消毒和灭菌的区别
条件 结果 常用的方法
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
2. 无菌技术
(1)消毒和灭菌的区别
条件 结果 常用的方法
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
2. 无菌技术
(1)消毒和灭菌的区别
(2)无菌技术具体操作
　　①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
　　②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
　　③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
　　④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
3. 纯化大肠杆菌以及菌种的保藏
　　(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
　　(2)纯化大肠杆菌
　　①原理：
　　②方法： 　　
3. 纯化大肠杆菌以及菌种的保藏
　　(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
　　(2)纯化大肠杆菌
　　①原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。
　　②方法：平板划线法、稀释涂布平板法。　　
(3)菌种的保藏
　　①短期保存：固体斜面培养基上4℃保存，菌种易被污染或产生变异。
　　②长期保存：－20℃甘油管在冷冻箱中保藏。
感悟拓展
　　酒精消毒时，75%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。
要点归纳
一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1. 选择合适的培养基
　　(1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基
培养基
种类 特点 用途
选择培
养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；用尿素为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌)
鉴别培
养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
　　(2)分离分解尿素的细菌的培养基即为选择培养基。培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。
2. 统计菌落数目的方法
　(1)显微镜直接计数法
　　　
　(2)间接计数法(活菌计数法)
　　　
2. 统计菌落数目的方法
　(1)显微镜直接计数法
　　　①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
　　②方法：用计数板计数。
　　③缺点：不能区分死菌与活菌。
　(2)间接计数法(活菌计数法)
　　
2. 统计菌落数目的方法
　(1)显微镜直接计数法
　　　①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
　　②方法：用计数板计数。
　　③缺点：不能区分死菌与活菌。
　(2)间接计数法(活菌计数法)
　　　①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长着一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作
　　a. 设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
　　b. 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝C/V×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
3. 细菌分离与计数的实验流程
　　土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。
1. 纤维素酶
　　是一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
2. 纤维素分解菌的筛选原理
　　(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
　　(2)纤维素分解菌能增生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。
二、分解纤维素的微生物的分离
3. 土壤中纤维素分解菌的筛选
　　(1)方案：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
　　(2)选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
　　(3)涉及的微生物技术主要有：培养基的制作、无菌操作、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。
感悟拓展
　　1. 培养基利用纤维素分解菌的选择培养基和鉴别纤维素分解菌的培养基。
　　(1)纤维素分解菌的选择培养基
培养基组成 提供主要的营养物质
纤维素粉(5 g) 碳源(能源)
NaNO3(1 g) 氮源、无机盐
Na2HPO4·7H2O(1.2 g)、KH2PO4(0.9 g)、MgSO4H2O(0.5 g)，
KCl(0.5 g) 无机盐
酵母膏(0.5 g) 生长因子、 碳源、氮源
水解酪素(0.5 g) 氮源、生长因子
上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000 mL 水
培养基组成 提供的主要营养物质
CMC Na(5～10 g) 碳源
酵母膏(1 g) 碳源、氮源、生长因子
KH2PO4(0.25 g) 无机盐
土豆汁(100 mL) 碳源、生长因子
琼脂(15 g) 凝固剂
上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000 mL 水
(2)鉴别纤维素分解菌的培养基(固体培养基)
方法一 方法二
过程 培养基长出菌落→覆盖CR(1mg/mL) 倒出CR→加入NaCI溶液(1moI/L) 　　倒掉NaCI溶液→产生透明圈 配制CR(10mg/mL)溶液→灭菌→按照1mLCR溶液/200mL培养基比例混匀→倒平板→培养→透明圈
优点 显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 操作简便，不存在菌落的混杂问题
缺点 操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂 ①由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含淀粉类物质，可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性反应
②有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显透明圈，与纤维素分解菌不易区分
2.两种常用刚果红(CR)染色法的比较
第 三 讲
植物的组织培养技术
要点归纳
　　1. 原理
　　(1)植物细胞全能性的概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成完整植株的潜能。
　　(2)高度分化的植物细胞全能性表达的条件
　　①离体条件；
　　②无菌操作(防止杂菌污染)；
　　③适宜物质的诱导和调节(激素主要是生长素、细胞分裂素等)；
　　④种类齐全、比例适合的营养物质；
　　⑤温度、酸碱度、光照等条件的控制。
2. 基本过程
3. 影响植物培养的因素
(1)外植体的选取
　　①不同植物的组织培养难度不同。
　　②对于同一种植物材料，材料的年龄，保存时间的长短等也会影响实验结果。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。
(2)培养基的配制(MS培养基)
　　①大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
　　②微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co。
　　③有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。
　　④pH、温度、光照
　　不同的植物对各种条件的要求往往不同。菊花适宜条件：pH在5.8左右；温度控制在18～22℃；每日日光灯光照12h。
典例导悟
　　1. 如图为科学家将胡萝卜韧皮部的细胞培养形成胡萝卜植株的过程示意图(注：胚状体即等同于植物种子的胚的结构)。
要点归纳
第4讲 DNA的粗提取和鉴定
1. 基本原理
　　(1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低；
　　(2)DNA不溶于酒精溶液；
　　(3)DNA不被蛋白酶所水解；
　　(4)DNA可被二苯胺染成蓝色。
方法 目的
溶于NaCl溶液中并稀释 ①NaCl浓度为2mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质
②当NaCl溶液稀释至0.14 mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl中的部分蛋白质和其他杂质
加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质
加入冷却酒精(95%) DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质
加入二苯胺，并沸水浴 鉴定DNA
2. 方法目的