基因工程的原理和技术
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文档简介
(共37张PPT)
基因工程的基本操作步骤
1、获得目的基因
2、形成重组DNA分子
3、将重组DNA分子导入受体细胞
4、筛选含有目的基因的受体细胞
5、目的基因的表达
一、获得目的基因
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
化学合成法
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
基因组文库
部分基因文库
基因组DNA文库
cDNA文库
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因
利用PCR提取目的基因
PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
原理：DNA双链复制
原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子
PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
前提:
已知目的基因的脱氧核苷酸序列
方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后DNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。
指数增长
归纳
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
72℃
94℃
55℃
PCR循环
1
2
3
4
5
22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）
PCR反应
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
适温延伸
3
高温变性
1
低温退火
2
重复1~3步
25~30轮
目的DNA片段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
50℃
引物1
引物2
DNA引物
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
引物1
引物2
DNA引物
72℃
Taq酶
Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第1轮结束
第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第2轮结束
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
重复30轮后
230=1,073,741,824
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增
第3轮扩增
第4轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
理想拷贝数=2n
n 循环次数
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85
n 循环次数
从基因文库中获取
利用PCR技术扩增
利用化学方法人工合成
归纳：获取目的基因的方法
2构建载体
形成重组DNA分子
方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
将重组DNA分子导入受体细胞
导入植物细胞
补充归纳导入方法
（重组DNA分子导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）
将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
导入动物的方法
将目的基因导入动物细胞
显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）
导入微生物
将目的基因导入微生物细胞
4检测和鉴定
Ca2＋处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。
筛选含有目的基因的受体细胞
目的基因的表达
检测:
是否插入目的基因
是否转录
是否翻译
鉴定:
功能活性鉴定
抗性鉴定
分别提取什么进行检测
DNA
附着在膜上
硝化纤维素
加探针
报告基因（含荧光素分子）
变性
DNA杂交
（如检测SARS病毒等）
a
b
c
d
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。
②检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。
③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。
④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。
提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
32．（8分）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，
饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备
过程相关的图和表。(08江苏)
请根据以上图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的
DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是
耐高温
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数
量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2
为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高
的退火温度？__________。
引物对B
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱
基序列是否有专一性要求？ 。
（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的
细菌B通常为 。
否
农杆菌
（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。
2
1
一 原核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
调控遗传信息的表达
(调控序列)
编码蛋白质
(编码序列)
一 原核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶
A G G T C A C G T C G
T C C A G T G C A G C
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
A G G T C A C G T C G
T C C A G T G C A G C
RNA聚合酶
A G G U C A C G U C G
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
A G G T C A C G T C G
T C C A G T G C A G C
A G G U C A C G U C G
二 真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
编码区下游
调控遗传信息的表达
(调控序列)
外显子
(能编码蛋白质)
内含子
(不能编码蛋白质)
基因工程的基本操作步骤
1、获得目的基因
2、形成重组DNA分子
3、将重组DNA分子导入受体细胞
4、筛选含有目的基因的受体细胞
5、目的基因的表达
一、获得目的基因
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
化学合成法
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
基因组文库
部分基因文库
基因组DNA文库
cDNA文库
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因
利用PCR提取目的基因
PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
原理：DNA双链复制
原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子
PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
前提:
已知目的基因的脱氧核苷酸序列
方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后DNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。
指数增长
归纳
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
72℃
94℃
55℃
PCR循环
1
2
3
4
5
22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）
PCR反应
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
适温延伸
3
高温变性
1
低温退火
2
重复1~3步
25~30轮
目的DNA片段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
50℃
引物1
引物2
DNA引物
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
引物1
引物2
DNA引物
72℃
Taq酶
Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第1轮结束
第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第2轮结束
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
重复30轮后
230=1,073,741,824
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增
第3轮扩增
第4轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
理想拷贝数=2n
n 循环次数
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85
n 循环次数
从基因文库中获取
利用PCR技术扩增
利用化学方法人工合成
归纳：获取目的基因的方法
2构建载体
形成重组DNA分子
方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
将重组DNA分子导入受体细胞
导入植物细胞
补充归纳导入方法
（重组DNA分子导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）
将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
导入动物的方法
将目的基因导入动物细胞
显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）
导入微生物
将目的基因导入微生物细胞
4检测和鉴定
Ca2＋处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。
筛选含有目的基因的受体细胞
目的基因的表达
检测:
是否插入目的基因
是否转录
是否翻译
鉴定:
功能活性鉴定
抗性鉴定
分别提取什么进行检测
DNA
附着在膜上
硝化纤维素
加探针
报告基因（含荧光素分子）
变性
DNA杂交
（如检测SARS病毒等）
a
b
c
d
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。
②检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。
③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。
④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。
提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
32．（8分）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，
饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备
过程相关的图和表。(08江苏)
请根据以上图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的
DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是
耐高温
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数
量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2
为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高
的退火温度？__________。
引物对B
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱
基序列是否有专一性要求？ 。
（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的
细菌B通常为 。
否
农杆菌
（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。
2
1
一 原核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
调控遗传信息的表达
(调控序列)
编码蛋白质
(编码序列)
一 原核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶
A G G T C A C G T C G
T C C A G T G C A G C
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
A G G T C A C G T C G
T C C A G T G C A G C
RNA聚合酶
A G G U C A C G U C G
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
A G G T C A C G T C G
T C C A G T G C A G C
A G G U C A C G U C G
二 真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
编码区下游
调控遗传信息的表达
(调控序列)
外显子
(能编码蛋白质)
内含子
(不能编码蛋白质)