基因工程的操作程序
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(共22张PPT)
基因工程的基本操作程序
一 基因工程的原理
1、概念：
按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
基因工程的别名
实质
操作环境
操作对象
操作水平
基本过程
结果
基因拼接技术或DNA重组技术
生物体外
基 因
DNA分子水平
剪切→拼接→导入→表达
人类需要的基因产物
人工（基因重组）
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质
：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质
编码区
非编码区
②有调控遗传信息表达的核苷酸序列：
启动子、
一段有特殊结构的DNA片断，基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录——启动子
终止子
一段有特殊结构的DNA片断，基因的尾端，使转录终止——终止子
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
编码区
非编码区
能编码蛋白质的序列
非编码序列：
包括非编码区和内含子
不能编码蛋白质的序列
内含子：
外显子：
①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质
②有调控遗传信息表达的核苷酸序列：
启动子、
终止子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是
_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
主要是编码蛋白质的结构基因
初始目的基因的来源
1. 从生物中直接获取
2. 人工合成
基因工程基本操作的步骤
也可以是一些具有调控作用的因子
如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。
注意：要保持基因的完整性
用限制酶切断成许多片段
1.直接分离基因——鸟枪法（散弹射击法）
运载体
供体细胞中DNA
许多DNA片段
载入
导入
受体细胞
产生特定性状
目的基因
分离
外源DNA
扩增
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。
用限制酶切断成许多片段
用限制酶切断成许多片段
用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定的方法将目的基因的DNA片段分离出来。
目的基因的mRNA
单链cDNA
反转录
双链DNA
（即目的基因／双链cDNA）
合成
(1)反转录法
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
推测
化学合成
推测
2.人工合成基因法
(2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法
合成的基因中均无内含子和启动子
杂交双链（RNA-DNA)
核酸酶H
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点 缺点
鸟枪法
反转录法
根据已知氨基酸合成DNA法
操作简便广泛使用
工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因
专一性强
操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高
专一性强
仅限于合成核苷酸对较少的简单基因
现在常用的获得目的基因的方法有哪些呢？
1、从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库
（gene library）
基因组文库
部分基因文库（如cDNA文库）
基因组文库:
包含了一种生物所有的基因的基因文库
部分基因文库:
包含了一种生物的一部分基因的基因文库
如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质 等特性。
是否一定要构建基因文库？
未知目的基因序列时
已知目的基因序列时
2、人工合成：
基因比较小，核苷酸序列已知
DNA合成仪
3、PCR技术扩增目的基因：
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。
① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________ 前提条件
_______________、 ___________ 、 ___________.
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）
⑤结果：
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
一段已知目的基因的核苷酸序列
四种脱氧核苷酸
一对引物
热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
(二)利用PCR技术扩增目的基因
基因表达载体的组成：
复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
二、基因表达载体的构建——核心
质粒
DNA分子
限制酶处理
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法
转化
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
转化
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体
体外显微注射入受精卵
受精卵移植
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
转化
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞
显微注射技术
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理
四、目的基因的检测与鉴定
检测—
鉴定——
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原—抗体杂交
基因工程的基本操作程序
一 基因工程的原理
1、概念：
按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
基因工程的别名
实质
操作环境
操作对象
操作水平
基本过程
结果
基因拼接技术或DNA重组技术
生物体外
基 因
DNA分子水平
剪切→拼接→导入→表达
人类需要的基因产物
人工（基因重组）
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质
：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质
编码区
非编码区
②有调控遗传信息表达的核苷酸序列：
启动子、
一段有特殊结构的DNA片断，基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录——启动子
终止子
一段有特殊结构的DNA片断，基因的尾端，使转录终止——终止子
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
编码区
非编码区
能编码蛋白质的序列
非编码序列：
包括非编码区和内含子
不能编码蛋白质的序列
内含子：
外显子：
①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质
②有调控遗传信息表达的核苷酸序列：
启动子、
终止子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是
_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
主要是编码蛋白质的结构基因
初始目的基因的来源
1. 从生物中直接获取
2. 人工合成
基因工程基本操作的步骤
也可以是一些具有调控作用的因子
如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。
注意：要保持基因的完整性
用限制酶切断成许多片段
1.直接分离基因——鸟枪法（散弹射击法）
运载体
供体细胞中DNA
许多DNA片段
载入
导入
受体细胞
产生特定性状
目的基因
分离
外源DNA
扩增
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。
用限制酶切断成许多片段
用限制酶切断成许多片段
用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定的方法将目的基因的DNA片段分离出来。
目的基因的mRNA
单链cDNA
反转录
双链DNA
（即目的基因／双链cDNA）
合成
(1)反转录法
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
推测
化学合成
推测
2.人工合成基因法
(2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法
合成的基因中均无内含子和启动子
杂交双链（RNA-DNA)
核酸酶H
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点 缺点
鸟枪法
反转录法
根据已知氨基酸合成DNA法
操作简便广泛使用
工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因
专一性强
操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高
专一性强
仅限于合成核苷酸对较少的简单基因
现在常用的获得目的基因的方法有哪些呢？
1、从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库
（gene library）
基因组文库
部分基因文库（如cDNA文库）
基因组文库:
包含了一种生物所有的基因的基因文库
部分基因文库:
包含了一种生物的一部分基因的基因文库
如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质 等特性。
是否一定要构建基因文库？
未知目的基因序列时
已知目的基因序列时
2、人工合成：
基因比较小，核苷酸序列已知
DNA合成仪
3、PCR技术扩增目的基因：
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。
① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________ 前提条件
_______________、 ___________ 、 ___________.
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）
⑤结果：
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
一段已知目的基因的核苷酸序列
四种脱氧核苷酸
一对引物
热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
(二)利用PCR技术扩增目的基因
基因表达载体的组成：
复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
二、基因表达载体的构建——核心
质粒
DNA分子
限制酶处理
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法
转化
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
转化
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体
体外显微注射入受精卵
受精卵移植
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
转化
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞
显微注射技术
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理
四、目的基因的检测与鉴定
检测—
鉴定——
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原—抗体杂交