动物的克隆
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(共49张PPT)
小资料：
20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。
1、广义的动物组织培养(组培)包括：
2、动物组织培养技术的发展：
1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。
1903年，皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，存活1个月。
1907年，美，蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。
细胞培养、组织培养和器官培养。
一、动物细胞的培养和克隆形成
3、动物细胞培养
将动物体的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。
一、动物细胞的培养和克隆形成
动物细胞的培养过程
幼龄动物
取动物器官
和组织
剪碎组织
胰蛋白酶处理
细胞培养
单个细胞
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
思考：
2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？
1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？
3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？
主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等
因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
培养过程：
动物胚胎或幼龄动物
的组织、器官
细胞悬浮液
胰蛋白酶
10代细胞
原代培养
50代细胞
传代培养
细胞株
无限传代
细胞系
剪碎
细胞的全能性
细胞株、细胞系
植物体
培养结果
获得细胞或细胞产物
快速繁殖、培育无病毒植株等
培养目的
葡萄糖、动物血清
蔗糖、植物激素
培养基特有成分
液体培养基
固体培养基
培养基性质
细胞增殖
原理
动物细胞培养
植物组织培养
比较项目
植物细胞和动物细胞培养的比较
4、动物组织培养
动物组织在体外以及人工条件下维持生活状态或生长特性。
一、动物细胞的培养和克隆形成
5、器官培养
★如何获得纯系的细胞系？
把一个细胞从群体中分离出来培养
（克隆培养法）
二、克隆培养法
1、克隆培养法概念：
2、特征：
3、基本要求：
遗传性状均一、表现性状相似。便于研究。
必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个。
把一个细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等位概念）
二、克隆培养法
4、提高克隆形成率的措施：
5、用途：
选择适宜的培养基、添加血清、激素刺激、 CO2培养箱、PH值等
如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。
★动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境
（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
2、营养
（氨基酸、无机盐、维生素、葡萄糖、动物血清等）
3、温度和pH
36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4
4、气体环境：
CO2培养箱
保证细胞顺利的生长增殖
细胞贴壁
细胞贴壁：
细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。
有关概念:
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，（10代以外的培养），称为传代培养。
细胞系、细胞株
原代培养
传代培养
…………
原代培养物
细胞系
原代培养物在首次
传代时就成为细胞系
可连
续培
养的
连续
细胞系
不能连续培养的
有限
细胞系
细胞系、细胞株
细胞株：
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称为细胞株。
细胞株一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、
病毒敏感性和生化特性等。
连续细胞株
有限细胞株
细胞系：泛指可以传代的细胞；
细胞株: 具有特殊性质的细胞系
三、动物的细胞融合技术及其应用
★ 什么是细胞融合技术？
★ 为什么要进行细胞融合？
★ 如何实现细胞融合？
三、动物的细胞融合技术及其应用
（一）细胞融合与细胞杂交
细胞A
细胞B
杂种细胞
灭活的病毒
物理法
化学法
仙台病毒
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒
动物细胞融合
细胞核
病毒颗粒
细胞核
灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿过
细胞膜连接
动物细胞融合
细胞融合，形成杂种细胞
细胞融合方法：
化学：PEG（聚乙二醇）
物理：电融合
生物：灭活的病毒（仙台病毒）
仙台病毒
紫外线
丧失感染性
（不感染细胞）
保留融合活性
（诱导细胞融合）
主要用于制备单克隆抗体
获得杂种植株
用 途
物理、化学方法
（同左）
灭活的病毒
物理（离心、振荡、电刺激）
化学（聚乙二醇）
诱导方法
使细胞分散后诱导细胞融合
去除细胞壁后诱导原生质体融合
细胞融合的方法
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
细胞融合的原理
动物细胞融合
植物体细胞杂交
比较项目
比较项目
植物、动物细胞融合的比较
（二） 杂交瘤技术和单克隆抗体制备
读下面一段文字资料，思考以下问题：
长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。
什么是抗体？
由何种细胞产生？
主要分布在哪里？
起何作用？
什么是单
克隆抗体？
效应B细胞
血清
特异性免疫作用
抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体。
． 克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
单克隆抗 体
讨论：怎样才能获得单克隆抗体？
提示1：仅用细胞培养技术可行吗？
提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？
提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？
设计方案：
一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体
小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖
-化学性质单一、特异性强的抗体。
杂种细胞
单克隆抗 体
单克隆抗体制备过程
注射抗原
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞
细胞培养
筛选，继续培养
足够数量的、能产生特定抗体的细胞群
体外培养
注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
诱导其融合的方法有哪些？
两次筛选分别有什么目的？
本过程利用了哪些原理？
为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？
第一次筛选得到杂交瘤细胞
第二次筛选出特异抗体的细胞群。
免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理
细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。
骨髓瘤细胞？
选出能产生特定抗体的细胞群、继续培养
体外培养
从培养液中获取
三、单克隆抗体制备过程
抗原？
淋巴细胞？
体内培养
从腹水中提取
单克隆抗体
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞
细胞培养
思 考：
（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？
（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？
细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。
（２）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？
有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。
（４）制备过程为何要经过两次筛选？
第一次筛选得到杂交瘤细胞
第二次筛选出特异抗体的细胞群。
(5) 本过程利用了哪些原理？
免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理
（３）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？
细胞融合技术、细胞培养技术。
四、动物的克隆繁殖
★理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？
★动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？
受精卵
>
胚胎干细胞
>
多能干细胞
>
单能干细胞
>
体细胞
四、动物的克隆繁殖
（一）动物细胞全能性的表现程度
如多能造血干细胞：可分化为红细胞、白细胞、血小板等
（2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅的上皮细胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。
（1）高等动物细胞
（二）动物难以克隆的根本原因
在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴随着它们发育过程中在时间、空间的变化，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。
四、动物的克隆繁殖
核移植
胚胎细胞核移植
体细胞核移植（难度高）
1、基本过程：动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.
(三)细胞核移植实验和动物的克隆繁殖
四、动物的克隆繁殖
细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：
胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞。
2.培育过程
去核卵细胞
体细胞核
细胞核移植
重组细胞
电脉冲刺激
早期胚胎(或重组胚胎）
胚胎移植
母体子宫
妊娠、出生
个体
3、原理
动物体细胞核具有全能性
绵羊“多莉”克隆过程：
卵细胞
Ａ母绵羊
Ｂ母绵羊
乳腺细胞
细胞质
细胞核
细胞核移植
早期胚胎
卵裂
C母绵羊子宫
胚胎移植
多莉羊
分娩
妊娠
多莉羊的培育过程
融合后的卵细胞
克隆羊成功的分子细胞生物学机理：
体细胞克隆成功的意义：
1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。
2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。
应用：
为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。
重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白，经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。
思考题
1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？
２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？
３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？
４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？
５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？
没有
是
成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖
先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理
胰蛋白酶水解蛋白质
细胞间的成份是蛋白质
思考题
６、细胞膜的主要成份是什么？
７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？
８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？
９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？
蛋白质和磷脂
能
注意时间的控制
不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近
胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛
思考题
11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？
12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？
13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？
易于培养细胞贴壁，进行生长增殖
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。
将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。
这样的过程叫做传代培养
思考题
14、如何理解原代培养和传代培养？
15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？
16、有些为何能一直传下去吗？
17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？
18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？
上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养
不都能
发生突变，朝着癌细胞方向发展
不是
保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展
A 、 B细胞为动物细胞,请据图回答问题:
A细胞
B细胞
C细胞
D细胞
(1)若A细胞为骨髓瘤细胞B细胞为淋巴细胞,那么D细胞称为 细胞,D细胞具有两个亲本细胞的特征,一方面因具有骨髓瘤细胞的 性质,通过 方式产生大量细胞,我们称之为 过程;另一方面能分泌大量的抗体,我们把该过程分泌的抗体称 .
杂交瘤
连续分裂
有丝分裂
单克隆
单克隆抗体
练一练
(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合成该物质的场所是 ,它是由 控制合成的,合成过程包括 和 两个重要步骤.
球蛋白
核糖体
基因
转录
翻译
(3)D细胞中产生的抗体具有 作用,与血清抗体相比其优越之处在于 强, 高.
免疫
特异性
灵敏度
(4)若A为人细胞,B为鼠细胞,用同位素标记A细胞膜上的蛋白质,B不标记,在C细胞时,检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有.在D细胞时,检测结果发现整个细胞都有放射性,请解释原因 .
构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动
练一练
小资料：
20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。
1、广义的动物组织培养(组培)包括：
2、动物组织培养技术的发展：
1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。
1903年，皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，存活1个月。
1907年，美，蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。
细胞培养、组织培养和器官培养。
一、动物细胞的培养和克隆形成
3、动物细胞培养
将动物体的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。
一、动物细胞的培养和克隆形成
动物细胞的培养过程
幼龄动物
取动物器官
和组织
剪碎组织
胰蛋白酶处理
细胞培养
单个细胞
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
思考：
2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？
1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？
3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？
主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等
因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
培养过程：
动物胚胎或幼龄动物
的组织、器官
细胞悬浮液
胰蛋白酶
10代细胞
原代培养
50代细胞
传代培养
细胞株
无限传代
细胞系
剪碎
细胞的全能性
细胞株、细胞系
植物体
培养结果
获得细胞或细胞产物
快速繁殖、培育无病毒植株等
培养目的
葡萄糖、动物血清
蔗糖、植物激素
培养基特有成分
液体培养基
固体培养基
培养基性质
细胞增殖
原理
动物细胞培养
植物组织培养
比较项目
植物细胞和动物细胞培养的比较
4、动物组织培养
动物组织在体外以及人工条件下维持生活状态或生长特性。
一、动物细胞的培养和克隆形成
5、器官培养
★如何获得纯系的细胞系？
把一个细胞从群体中分离出来培养
（克隆培养法）
二、克隆培养法
1、克隆培养法概念：
2、特征：
3、基本要求：
遗传性状均一、表现性状相似。便于研究。
必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个。
把一个细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等位概念）
二、克隆培养法
4、提高克隆形成率的措施：
5、用途：
选择适宜的培养基、添加血清、激素刺激、 CO2培养箱、PH值等
如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。
★动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境
（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
2、营养
（氨基酸、无机盐、维生素、葡萄糖、动物血清等）
3、温度和pH
36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4
4、气体环境：
CO2培养箱
保证细胞顺利的生长增殖
细胞贴壁
细胞贴壁：
细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。
有关概念:
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，（10代以外的培养），称为传代培养。
细胞系、细胞株
原代培养
传代培养
…………
原代培养物
细胞系
原代培养物在首次
传代时就成为细胞系
可连
续培
养的
连续
细胞系
不能连续培养的
有限
细胞系
细胞系、细胞株
细胞株：
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称为细胞株。
细胞株一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、
病毒敏感性和生化特性等。
连续细胞株
有限细胞株
细胞系：泛指可以传代的细胞；
细胞株: 具有特殊性质的细胞系
三、动物的细胞融合技术及其应用
★ 什么是细胞融合技术？
★ 为什么要进行细胞融合？
★ 如何实现细胞融合？
三、动物的细胞融合技术及其应用
（一）细胞融合与细胞杂交
细胞A
细胞B
杂种细胞
灭活的病毒
物理法
化学法
仙台病毒
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒
动物细胞融合
细胞核
病毒颗粒
细胞核
灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿过
细胞膜连接
动物细胞融合
细胞融合，形成杂种细胞
细胞融合方法：
化学：PEG（聚乙二醇）
物理：电融合
生物：灭活的病毒（仙台病毒）
仙台病毒
紫外线
丧失感染性
（不感染细胞）
保留融合活性
（诱导细胞融合）
主要用于制备单克隆抗体
获得杂种植株
用 途
物理、化学方法
（同左）
灭活的病毒
物理（离心、振荡、电刺激）
化学（聚乙二醇）
诱导方法
使细胞分散后诱导细胞融合
去除细胞壁后诱导原生质体融合
细胞融合的方法
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
细胞融合的原理
动物细胞融合
植物体细胞杂交
比较项目
比较项目
植物、动物细胞融合的比较
（二） 杂交瘤技术和单克隆抗体制备
读下面一段文字资料，思考以下问题：
长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。
什么是抗体？
由何种细胞产生？
主要分布在哪里？
起何作用？
什么是单
克隆抗体？
效应B细胞
血清
特异性免疫作用
抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体。
． 克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
单克隆抗 体
讨论：怎样才能获得单克隆抗体？
提示1：仅用细胞培养技术可行吗？
提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？
提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？
设计方案：
一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体
小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖
-化学性质单一、特异性强的抗体。
杂种细胞
单克隆抗 体
单克隆抗体制备过程
注射抗原
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞
细胞培养
筛选，继续培养
足够数量的、能产生特定抗体的细胞群
体外培养
注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
诱导其融合的方法有哪些？
两次筛选分别有什么目的？
本过程利用了哪些原理？
为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？
第一次筛选得到杂交瘤细胞
第二次筛选出特异抗体的细胞群。
免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理
细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。
骨髓瘤细胞？
选出能产生特定抗体的细胞群、继续培养
体外培养
从培养液中获取
三、单克隆抗体制备过程
抗原？
淋巴细胞？
体内培养
从腹水中提取
单克隆抗体
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞
细胞培养
思 考：
（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？
（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？
细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。
（２）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？
有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。
（４）制备过程为何要经过两次筛选？
第一次筛选得到杂交瘤细胞
第二次筛选出特异抗体的细胞群。
(5) 本过程利用了哪些原理？
免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理
（３）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？
细胞融合技术、细胞培养技术。
四、动物的克隆繁殖
★理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？
★动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？
受精卵
>
胚胎干细胞
>
多能干细胞
>
单能干细胞
>
体细胞
四、动物的克隆繁殖
（一）动物细胞全能性的表现程度
如多能造血干细胞：可分化为红细胞、白细胞、血小板等
（2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅的上皮细胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。
（1）高等动物细胞
（二）动物难以克隆的根本原因
在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴随着它们发育过程中在时间、空间的变化，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。
四、动物的克隆繁殖
核移植
胚胎细胞核移植
体细胞核移植（难度高）
1、基本过程：动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.
(三)细胞核移植实验和动物的克隆繁殖
四、动物的克隆繁殖
细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：
胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞。
2.培育过程
去核卵细胞
体细胞核
细胞核移植
重组细胞
电脉冲刺激
早期胚胎(或重组胚胎）
胚胎移植
母体子宫
妊娠、出生
个体
3、原理
动物体细胞核具有全能性
绵羊“多莉”克隆过程：
卵细胞
Ａ母绵羊
Ｂ母绵羊
乳腺细胞
细胞质
细胞核
细胞核移植
早期胚胎
卵裂
C母绵羊子宫
胚胎移植
多莉羊
分娩
妊娠
多莉羊的培育过程
融合后的卵细胞
克隆羊成功的分子细胞生物学机理：
体细胞克隆成功的意义：
1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。
2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。
应用：
为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。
重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白，经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。
思考题
1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？
２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？
３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？
４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？
５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？
没有
是
成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖
先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理
胰蛋白酶水解蛋白质
细胞间的成份是蛋白质
思考题
６、细胞膜的主要成份是什么？
７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？
８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？
９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？
蛋白质和磷脂
能
注意时间的控制
不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近
胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛
思考题
11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？
12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？
13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？
易于培养细胞贴壁，进行生长增殖
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。
将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。
这样的过程叫做传代培养
思考题
14、如何理解原代培养和传代培养？
15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？
16、有些为何能一直传下去吗？
17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？
18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？
上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养
不都能
发生突变，朝着癌细胞方向发展
不是
保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展
A 、 B细胞为动物细胞,请据图回答问题:
A细胞
B细胞
C细胞
D细胞
(1)若A细胞为骨髓瘤细胞B细胞为淋巴细胞,那么D细胞称为 细胞,D细胞具有两个亲本细胞的特征,一方面因具有骨髓瘤细胞的 性质,通过 方式产生大量细胞,我们称之为 过程;另一方面能分泌大量的抗体,我们把该过程分泌的抗体称 .
杂交瘤
连续分裂
有丝分裂
单克隆
单克隆抗体
练一练
(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合成该物质的场所是 ,它是由 控制合成的,合成过程包括 和 两个重要步骤.
球蛋白
核糖体
基因
转录
翻译
(3)D细胞中产生的抗体具有 作用,与血清抗体相比其优越之处在于 强, 高.
免疫
特异性
灵敏度
(4)若A为人细胞,B为鼠细胞,用同位素标记A细胞膜上的蛋白质,B不标记,在C细胞时,检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有.在D细胞时,检测结果发现整个细胞都有放射性,请解释原因 .
构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动
练一练