5.2《多聚酶链式反应扩增DNA片断》PPT课件（新人教版-选修1）

(共52张PPT)
新课标人教版课件系列
《高中生物》
选修１
课题２
《多聚酶链式反应扩增
DNA片断 》
专题５《DNA和蛋白质技术》
教学目标
（一）知识与技能
1、了解PCR技术的基本操作；
2、理解PCR的原理；3、讨论PCR的应用
（二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作
教学难点：PCR的原理
教学方法：启发式教学
一、基础知识
（一）DNA分子的结构
C、H、O、N、P
1、组成元素
脱氧核苷酸
2、基本单位
3、脱氧核苷酸结构
脱氧核苷酸
脱氧核苷
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
嘌呤
嘧啶
腺嘌呤（A）
鸟嘌呤（G）
胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
4、多脱氧核苷酸链得形成
脱氧核苷酸结构式
O
O
P
O
HO
碱基
O
OH
O
O
P
O
HO
OH
碱基
5’
3’
3’
5’
碱基
脱氧核糖
磷酸基团
碱基
脱氧核糖
碱基
脱氧核糖
5’
3’
多脱氧核苷酸链结构简图
5、DNA分子的双螺旋结构
① DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’ －3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构
②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧
③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对
6、利用碱基互补配对规律的计算
规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%，（A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G)＝1
规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的 (A+G) /(T+C)的值互为倒数关系
规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等
（二）DNA分子的特性
1、稳定性
在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来
例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％， A和T 占75%，哪一个稳定？
答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分子中含有较多的G－C碱基对比含有较多的A－T碱基稳定
2、多样性
构成DNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化
例题：如果有4000个碱基对，碱基对有多少种排列方式？
答：碱基对排列方式有44000种
3、特异性
不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的
（三）DNA的复制
2、时期
有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期
3、场所
细胞核（主）、线粒体、叶绿体
4、模板
DNA母链
1、概念
由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程
5、原材料
脱氧核苷酸
6、基本条件
酶、ATP、原料、模板
7、复制过程
① DNA的解旋
亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链
② RNA引物的合成
以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物
③ DNA的生成
以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。
④切掉引物生成冈崎片断
在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断
⑤ DNA片断的连接
在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA
边解旋边复制(过程）
8、复制特点
半保留复制（结果）
9、遵循原则
碱基互补配对原则
10、精确复制的原因
11、复制的意义
DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性
①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
①一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的2/2 N+1= 1/2N
②设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个，则该DNA复制n次后，形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为T=(2N-1)m
12、DNA复制过程中的等量关系
（四） PCR(多聚酶链式反应）
1、 DNA聚合酶特性
不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物
2、 DNA聚合酶作用过程
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸
3、 PCR原理
①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性
②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链
③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化
4、 Taq DNA聚合酶的应用
5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质
DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出
6、 PCR技术的特点
7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别
体内DNA的复制 体外的模拟
模板（母链） 细胞内源 外源加入
引物 引物合成酶 外源加入
底物dNTP 细胞内源 外源加入
聚合酶 细胞内源 外源加入
反应环境 细胞内环境 缓冲液
① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
8、细胞内复制和PCR不同点
② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
（五） PCR的反应过程
1、PCR的反应步骤
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸
①变性（模板DNA解旋）
模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备
2、循环过程
靶序列
靶序列
PCR 循环第一步 ：加热变性
②复性（退火）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合
靶序列
靶序列
引物 Ⅰ
引物 Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火
③延伸
DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链
靶序列
靶序列
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
聚合酶
PCR 循环第三步 ：引物延伸
靶序列
靶序列
第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列
循环次数 DNA数量
1 2
2 4
3 8
20 1,048,576
30 1,073,741,824
3、30次循环后靶序列扩增的数量
4、PCR 循环的结果
② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增
①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸
二、 PCR 的实验操作
1、PCR仪
（一）设备及用具
实质上一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
PCR仪
微量离心管
微量移液器
1、准备
2、移液
（二）实验操作步骤
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂
①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
②注意：
3、混合
B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀
A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序
①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s
4、离心
5、反应
②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果
循环数 变性 复性 延伸
第一次 94°C，10min － －
30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：
6、注意事项
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
（一）理论上DNA扩增数目的计算
三、课题成果评价
1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n
2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n
（二）实验中DNA含量的测定
1 、原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2 、过程
①稀释
2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
③计算
④计算
DNA含量（ g ）＝50 x (260nm的读数）
x 稀释倍数
50：1 g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
比色杯
四、 课题延伸
例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点
五、实验小结
PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。
模板
互补
Taq聚合酶
四种脱氧核苷酸
引物
变性、复性和延伸
72℃