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第二章 细胞工程
2.1 植物细胞工程
细胞工程是指应用_______________ ___________________和 的原理和方法,通过_______ _、_________ _上的操作,有目的的获得特定的___ __的一门综合性生物工程。
什么叫细胞工程?
按操作对象分
植物细胞工程
动物细胞工程
原理方法
研究目的
细胞生物学
分子生物学
细胞或组织水平
细胞器水平
细胞、组织、器官、个体或其产品
发育生物学
研究水平
1958
1960
1964
1971
1974
1902
1974年,土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后,该质粒应用于植物分子生物学领域,促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
1971年,卡尔森(P.S.Carlson,1944—2017)诱导烟草种间原生质体融合,获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1964年,古哈(S.Guha,1938—2007)等在培养毛曼陀罗的花药时,首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1960年,科金(E.C.Cocking,1931—)用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁,成功获得了原生质体。
1958年,斯图尔德(F.C.Steward,1904—1993)等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚,为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1902年,哈伯兰特(G.Haberlandt,1854—1945)提出了细胞全能性的理论,但相关的实验尝试没有成功。
科技探索之路 —— 植物细胞工程的发展历程
植物组织培养技术
从古至今,我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征,很多人喜欢养兰花。 但是兰花种子通常发育不全,在自然条件下萌发率极低;传统分株繁殖的方式,又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题,如果靠自然繁殖,兰花的价格可想而知了。
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖,从而走入寻常百姓家呢?
【从社会中来】
“其芽葺葺(qi),其叶青青,犹绿衣郎,挺节独立,可敬可慕。迨(dài)夫花开,凝晴瀼露,万态千妍,薰风自来,四坐芬郁,岂非入兰室乎!岂非有国香乎!”
一、植物细胞工程的基本技术
1.全能性定义:
细胞经过分裂和分化后,仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
2.具有全能性的原因:
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。
3.体现全能性的标志:
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
实例:胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
受精卵发育成个体(动植物)
蜜蜂受精卵发育成工蜂,卵细胞发育成雄峰
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
4.不体现全能性的实例:
芽原基只能发育为芽,叶原基只能发育为叶
5.不体现全能性的原因:
基因在特定时间、空间条件下选择性表达
1.细胞的全能性:P34
6.全能性大小的比较:
①受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞>体细胞;
②植物细胞>动物细胞。
随着细胞分化程度的不断提高,细胞的全能性逐渐降低。
(一)植物组织培养技术
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
1.概念:
3.一般过程:
指离体的植物器官、组织或细胞等,培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱导其分化为完整植株的技术。
移栽成活
2.理论基础:
植物细胞的全能性
植物细胞工程的基本技术
外植体
生殖方式:无性生殖
分裂方式:有丝分裂
2.植物组织培养的一般过程
①相关概念 教材P35
脱分化:
在___________________条件的诱导下,已经分化的细胞__________________,转变为_____________,进而形成_________的过程。
一定的激素和营养等
失去其特有的结构和功能
未分化的细胞
愈伤组织
愈伤组织:
不定形的薄壁组织团块。
再分化:
愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。
适宜的培养条件:
(1)离体状态
(2)无菌操作
(3)种类齐全、比例适合的营养物质
(4)植物激素(主要是生长素和细胞分裂素)诱导和调节
(5)适宜的外界条件(温度、pH、光照等)
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
5.探究-实践
菊花的组织培养
原理:
步骤:
1)制备外植体
2)接种到诱导愈伤组织培养基
3)接种到诱导生芽培养基
4)接种到诱导生根培养基
① 植物细胞一般具有___________;
② 植物激素中______和__________是启动_________、______和______
关键激素,它们的_____、_____等都会影响植物细胞的发育方向;
生长素
细胞分裂素
细胞分裂
脱分化
再分化
浓度
比例
全能性
菊花的组织培养
(1)制备外植体
消毒:
切割:(无菌操作)
酒精
30S
无菌水
2-3次
次氯酸钠溶液
30min
材料:
幼嫩的菊花茎段
2-3次
无菌水洗
超净工作台或接种箱
消毒与无菌水冲洗
切割与接种
(2)接种到诱导愈伤组织培养基
脱分化 避光
形成愈伤组织
有光时,往往容易形成维管组织,而不易形成愈伤组织。
愈伤组织培养
培养温度:
18-220C
(3)接种到诱导生芽培养基
(4)接种到诱导生根培养基
接种室
试管苗
若先生根后面就不易生芽
移栽
培养室
根、芽
植物体
脱分化
再分化
培养条件:
①无菌
②营养物质
③适宜环境条件(温度、PH、光等)
④植物激素:
细胞分裂素 生长素
如:胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…
植物组织培养技术--过程
遮光
一定的光照
芽发育成叶,叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
排列不规则,高度液泡化,呈不定形状态的薄壁细胞
愈伤组织
离体的植物器官、组织或细胞(外植体)
愈伤组织重新分化为芽、根等器官
失去特有结构和功能转变成未分化的细胞
5. 进一步探究
若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响,则应如何设计对照实验?
① 空白对照:不加任何激素;
② 实验组1:生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1;
③ 实验组2:生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1;
④ 实验组3:生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
探究-实践
菊花的组织培养
使用顺序 实验结果
先使用生长素,后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂,但不利分化
先使用细胞分裂素后使用生长素 细胞既分裂、也分化
同时使用 分化频率高
使用比例 实验结果
生长素
细胞分裂素
>
生长素
细胞分裂素
<
生长素
细胞分裂素
=
有利于根的分化
有利于芽的分化,抑制根的分化
促进愈伤组织生长
【拓展】激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向:
深度思考
1、菊花组织培养过程中,诱导外植体脱分化形成愈伤组织的培养基,其成分中是否应含有蔗糖等有机物?为什么?
提示:含有,因为此时外植体不能进行光合作用制造有机物,需要依赖环境中的有机物才能生存。
2、菊花组织培养中,前后三次用到培养基其功能分别是什么?
提示:第一次:诱导外植体脱分化形成愈伤组织;第二次:诱导愈伤组织生芽;第三次:诱导愈伤组织生根。
(二)植物体细胞杂交技术
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招?
利用传统有性杂交方法能实现吗?为什么?
不能。因为不同种生物之间存在着生殖隔离
阅读课文36-38页,图2-4,讨论:
(1)要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起,遇到的第一个障碍是什么?
(2)怎样通过比较温和的方法去掉细胞壁?
(3)怎样诱导两个原生质体的融合(方法)?与细胞膜的什么特性有关?
(4)如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞,下一步如何将杂种细胞培育成杂种植株?
(5)这项技术的出现有什么意义?
(二)植物体细胞杂交技术
1.过程
植物细胞融合 + 植物组织培养
去壁
①
去壁
①
融
合 ②
再生
新壁
③
脱分化
④
再分化
⑤
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交
(二)植物体细胞杂交技术
原生质体
原生质层
(二)植物体细胞杂交技术
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质
①去壁原因: 。
②方法: 。
③相关酶: 。
*为什么用上述酶?___________________________________
*酶解法利用了原理?___________
*纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇,试分析原因?
细胞壁阻碍着细胞间的杂交(阻碍了原生质体间的融合)
酶解法
纤维素酶和果胶酶
植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶构成
酶的专一性
使溶液具有一定的渗透压,防止原生质体吸水过多而涨破,保持原生质体正常
(1)去除细胞壁
原生质体
原生质层
方法:
物理方法:电融合法、离心法
化学方法:聚乙二醇(PEG)融合法、
高Ca2+-高pH融合法
原理:细胞膜具有流动性
(二)植物体细胞杂交技术
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质
(2)原生质体间的融合
脱去细胞壁的细胞。动物细胞也可看做是原生质体。
融合的原生质体重新产生细胞壁,形成杂种细胞
思考:1、参与此过程中的主要细胞器是?
2、杂种细胞的染色体数是多少?
3、杂种细胞染色体组数是多少?
4、融合后,培养基中有几种类型的细胞?
(二)植物体细胞杂交技术
验证再生出新壁的实验:___________________
质壁分离和质壁分离复原实验
(3)细胞融合完成的标志*:__________________
高尔基体
两亲本染色体数之和
两亲本染色体组数之和
①未融合的细胞:A、B、 ②两两融合的细胞:AA、BB、AB ③多细胞融合体
需要进一步筛选
(4)(5)利用植物组织培养技术将杂种细胞培育成杂种植株。
植物体细胞杂交育种
杂交育种诱导多倍体
四倍体
四倍体
二倍体
意义:打破生殖隔离,实现远缘杂交育种。大大扩展杂交的亲本组合范围。
番茄马铃薯植株是异源四倍体。
(二)植物体细胞杂交技术
①原理:__________________
②植物体细胞杂交完成的标志*:
_______________
植物细胞的全能性
培育出杂种植株
项目 体细胞杂交 P1:2n(AaBb) 与 P2:2m(CcDd)
生殖类型
变异类型
染色体数
染色体组数
基因组成
无性繁殖,育种过程中不遵循孟德尔定律
染色体数目变异
两亲本染色体数之和。2n+2m
两亲本染色体组数之和。2+2
两亲本基因型之和。AaBbCcDd
植物体细胞杂交后代的遗传变化
若亲本植株可育,则杂种植株可育。杂种植株是不同于亲本的新物种。
从杂种植株的染色体组成上看属于何种变异?
染色体数目变异
(二)植物体细胞杂交技术
2.原理:
(二)植物体细胞杂交技术--小结
1.概念:
将不同来源的植物细胞,在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
4.步骤说明:
1)酶解法去壁:
细胞壁
纤维素酶、果胶酶
原生质体
2)理化法促融:
物理法:电融合法、离心法
化学法:聚乙二醇融合法、高Ca2+ —高PH融合法等
3)融合的原生质体再生出细胞壁为杂种细胞,可诱导形成愈伤组织
5.意义:
打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种。
细胞膜的流动性和细胞全能性
3.两个标志:
(1)植物细胞融合完成的标志:
再生出新的细胞壁
(2)植物体细胞杂交完成的标志:
培育成新植物体
植物组织培养 植物体细胞杂交技术
所属范畴
原理
步骤
意义
联系
无性繁殖
植物细胞全能性
①脱分化 ②再分化
保持优良性状 繁殖速度快 大规模生产提高经济效益
杂交技术应用了组织培养
克服不同种生物远缘杂交不亲和的障碍
①去除细胞壁②融合形成杂种细胞③组织培养
膜流动性和细胞全能性
染色体变异、基因重组
思考与探究 P38
为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有地上长番茄、地下结马铃薯?
生物基因的表达不是孤立的,是相互调控、相互影响的,虽杂种植株的细胞中具备两个物种的遗传物质,但这些遗传物质的表达受到相互干扰,不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达
思考:
若植株A和植株B细胞结构如图所思,A有X条染色体,B有Y条染色体,通过植物细胞融合技术获得杂种细胞AB,则:
①杂种细胞的染色体数为______
②杂种细胞的基因型为__________
③杂种细胞中染色体组数为________
④得到的杂种植株为____倍体
⑤理论上该植株可育吗?___________________________
X+Y
DdYyRr
4
四
可育,有同源染色体,同源染色体能联会,可形成配子
*异源四倍体
概念
植物细胞融合
原生质体制备
过程
变异类型
植物组织培养
原生质体融合
原理
育种类型
本堂小结:
原理
过程
花药离体培养
植物细胞具有全能性
操作步骤
脱分化
再分化
外植体
根、芽、胚状体
愈伤组织
外植体消毒
接种
切块
形成愈伤组织
诱导生芽生根
植物体细胞杂交
植物组织培养
植物细胞工程
优缺点