【学案】第1章 发酵工程：第2节第1课时 微生物的基本培养技术（word版含解析）

发酵工程：
第2节 微生物的培养技术及应用 第1课时 微生物的基本培养技术
学有目标——新课程标准必明 记在平时——核心语句必背
1.阐述培养基的种类、成分和配制方法。 2．说出消毒、灭菌的原理和方法。 3．进行纯化酵母菌的实验操作。 1.培养基中需含有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质。 2．消毒的目的是杀死物体表面或内部一部分微生物，灭菌则是杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 3．实验室常用煮沸消毒法、巴氏消毒法和使用化学药剂或紫外线进行消毒，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和湿热灭菌等。 4．微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
一、理清主干知识
一、培养基
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．种类(按物理性质分)
液体培养基固体培养基
3．营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。二者的区别如下表所示。
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
适用对象 操作空间、操作者的衣着和手等 微生物培养的器皿、接种用具和培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物消毒法和紫外线消毒法 湿热灭菌(其中高压蒸汽灭菌的效果最好)、干热灭菌、灼烧灭菌
　
三、微生物的纯培养
1．相关概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
(2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
(3)纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。
2．酵母菌的纯培养
二、诊断自学效果
1．判断下列叙述的正误
(1)所有的培养基中都要加入琼脂(×)
(2)微生物在液体培养基中生长可形成菌落(×)
(3)获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染(√)
(4)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用湿热灭菌法进行灭菌(×)
(5)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(×)
2．(2020·绵阳期末)下列关于无菌技术应用的叙述，正确的是(　　)
A．煮沸消毒可杀死物体内外所有的微生物
B．使用后的培养基可以直接丢弃
C．紫外线适用于物体表面和空气消毒
D．金属器具只能采用灼烧灭菌法进行灭菌
解析：选C　煮沸消毒只能杀死物体内外一部分微生物，A错误；使用后的培养基要经过灭菌处理后才可以丢弃，否则会引起微生物污染，B错误；紫外线适用于物体表面和空气消毒，C正确；金属器具也可以采用干热灭菌法进行灭菌，D错误。
3．关于实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作，下列说法正确的是(　　)
A．配制培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B．倒平板时，打开培养皿将锥形瓶中的培养基倒入
C．倒入培养基后立即将平板倒置，防止培养基受污染
D．划线接种时，灼烧接种环冷却后进行再次划线
解析：选D　倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行，而配制培养基不需要在酒精灯的火焰旁进行，A错误；倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(10～20 mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，而不能打开皿盖，B错误；倒平板后，需等培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置，C错误；划线接种时，灼烧接种环后要等待其冷却后才能进行再次划线，D正确。
[在探究中学明]
1．下面是查氏培养基(培养霉菌所用)的主要成分，根据下表，回答下列问题：
蔗糖 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O 琼脂 加水定容至 1 000 mL
15 g 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 20 g
(1)该培养基根据物理性质划分应是固体培养基，原因是该培养基中加入了凝固剂琼脂。
(2)该培养基包含微生物生长和繁殖所需要的 类营养物质(成分)，分别是碳源、氮源、无机盐和。
(3)表中蔗糖提供碳源，NaNO3提供氮源和无机盐。
(4)培养基在提供上述营养物质的基础上，还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(生长因子)以及O2的需求。
2．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
[在深化中提能]
1．培养基配制的原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH为6.5～7.5、放线菌的适宜pH为7.5～8.5、真菌的适宜pH为5.0～6.0。为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸氢二钾磷酸二氢钾。
2．培养基的成分
营养物质 定义 作用 主要来源
碳源 凡能提供碳元素的物质 构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质 无机碳源：NaHCO3、CO2等； 有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 凡能提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机氮源：N2、NH3、铵盐等； 有机氮源：尿素、牛肉膏等
生长因子 生长必不可少的微量有机物 是酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 — 不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定 培养基、空气、代谢产物
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
3．动物、微生物和绿色植物所需营养物质的比较
营养物质 动物 (异养型) 微生物 绿色植物 (自养型)
异养型 自养型
碳源 糖类、脂肪、蛋白质等 糖、醇、有机酸等 二氧化碳、碳酸盐等 二氧化碳、碳酸盐等
氮源 蛋白质或其降解产物等 蛋白质或其降解产物、有机氮化物、无机氮化物 无机氮(硫)化物 无机氮化物
能源 与有机碳源相同 与有机碳源相同 氧化无机物或利用光能 利用光能
4．几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，以及接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱160～170 ℃加热2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等，凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
湿热灭菌 高压蒸汽灭菌锅内100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 30 W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物 消毒 用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面的消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
　　　(2020·泰州月考)如表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是(　　)
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4g 4.0g 0.5g 0.5g 100 mL
A．此培养基可用来培养自养型微生物
B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C．若除去①，此培养基可培养硝化细菌
D．培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源
[解析]　此培养基中不含有机碳源，适合用来培养自养型微生物，A正确；此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源，B正确；硝化细菌能进行化能合成作用，但不能固氮，因此若除去①，此培养基不能培养硝化细菌，C错误；培养基中若加入氨基酸，它可作为碳源、氮源，D正确。
[答案]　C
　(2020·天津期末)在微生物培养过程中，关于灭菌和消毒的理解，错误的是(　　)
A．消毒是指杀死物体表面或内部部分微生物
B．灭菌是杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
C．实验中使用后的培养基丢弃前一定要进行消毒处理，以免污染环境
D．吸管和培养皿可以采用干热灭菌法
[解析]　消毒只能杀灭物体体表或内部的一部分微生物，不能杀死孢子和芽孢，A正确。灭菌是将处理物体中的一切生物全部杀灭。在经过灭菌后的物体中，不再存在任何活着的生命，包括芽孢和孢子，B正确。实验中使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境，C错误。常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和湿热灭菌等，吸管和培养皿可以采用干热灭菌法，D正确。
[答案]　C
[在应用中落实]
1．(2020·天津期末)下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是(　　)
A．利用稀释涂布平板法能分离微生物
B．培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性
C．培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素
D．在牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏只提供碳源，蛋白胨只提供氮源
解析：选D　分离微生物的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；配制培养不同微生物的培养基时都要将pH调至能够满足该种微生物的需要，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，即4.8～5.8，B正确；维生素是乳酸杆菌生长繁殖所必需的生长因子，在体内又不能合成，因此要在培养乳酸杆菌的培养基中添加维生
素，C正确；牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏和蛋白胨都可以提供碳源和氮源，D错误。
2．(2020·北京海淀区期中)微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(　　)
A．自来水常用氯气进行消毒
B．接种操作要在酒精灯火焰附近进行
C．大多数培养基要进行湿热灭菌
D．加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
解析：选D　水源常用氯气消毒，A正确；酒精灯火焰附近存在一个无菌区，为了避免杂菌污染，接种操作要在酒精灯火焰附近进行，B正确；大多数培养基要进行湿热灭菌，C正确；加入培养基中的指示剂和染料也需要灭菌，D错误。
[在探究中学明]
阅读教材第12、13页，完成以下问题
1．如果要调节培养基的pH，应该在哪一步操作之前进行？
提示：调节培养基的pH应该在配制培养基之后，灭菌之前进行。
2．下面是倒平板操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)请用序号和箭头表示出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。
(2)乙操作中的灭菌方法是灼烧灭菌。
(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
(4)倒平板时为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(5)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
提示：可以防止冷凝形成的水滴污染培养基，冲散菌落。
3．下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：
d→b→f→a→e→c→h→g。
(2)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(3)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
提示：以免接种环温度太高，杀死菌种。
(4)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(5)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
[在深化中提能]
1．倒平板操作的注意事项
(1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分更快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(6)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
2．平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个菌种繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
第一次操作 每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
　(2020·洛阳期中)如图是实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是(　　)
A．①步骤使用的培养基已经灭菌并调节过pH
B．①②③步骤操作时均需要在酒精灯火焰旁进行
C．④在恒温培养箱中培养时需要将平板倒置
D．④操作过程中，需灼烧接种环5次
[解析]　①为倒平板，该步骤使用的培养基已经灭菌并调节过pH，A正确；①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，B正确；④在恒温培养箱中培养时需要将平板倒置，防止冷凝水滴入培养基，造成污染，C正确；每次划线前后都要灼烧接种环，因此④操作过程中，需灼烧接种环6次，D错误。
[答案]　D
[在应用中落实]
1.接种微生物的方法很多，平板划线法是最常用的一种。如图是平板划线示意图，划线的顺序为①②③④。操作方法中错误的是(　　)
A．划线操作时，将沾有菌种的接种环插入培养基
B．平板划线后培养微生物时要倒置
C．不能将第④区域的划线与第①区域的划线相连
D．在②～④区域中划线前后都要对接种环进行灭菌
解析：选A　将沾有菌种的接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，而不能插入培养基；用平板培养基培养微生物时，为防止水蒸气凝集滴入培养基造成干扰或污染，应将平板倒过来放置培养；划线时要避免最后一区的划线与第一区相连，因为最后一区的细菌最少，而第一区的细菌最多，如果连在一起则有可能影响单个菌落的分离效果；在②～④区域中划线前都要对接种环进行灼烧灭菌，保证每次划线的菌种来自上一区域的末端，划线结束灼烧接种环是为了防止菌种污染环境。
2．如图是倒平板的操作，下列相关叙述错误的是(　　)
A．正确的操作顺序应该是丙→乙→甲→丁
B．甲在酒精灯火焰附近进行可以避免杂菌污染
C．丁操作必须要等待平板冷却凝固后才能进行
D．培养基应冷却到50 ℃倒平板是由于该温度下不易受杂菌污染
解析：选D　倒平板正确的操作顺序应该是丙→乙→甲→丁，A正确；将培养基倒入培养皿(甲)，在酒精灯火焰附近进行可以避免杂菌污染，B正确；丁为将培养皿倒置，必须要等待平板冷却凝固后才能进行，C正确；培养基冷却到50 ℃时既不烫手，也不发生凝固，适宜进行倒平板，而不是防止杂菌污染，D错误。
　　　　[课堂巩固落实]
1．(2019·江苏高考)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　　)
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽(湿热)灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养基被污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
解析：选A　培养微生物的器具不一定都要进行高压蒸汽灭菌，如接种环需要进行灼烧灭菌，A错误；接种前灼烧接种环的目的是彻底杀灭接种环上的细菌、芽孢等，接种后再灼烧是为了防止菌种逸出，污染接种室或者超净台，影响整体接种环境，B正确；接种后的培养皿要倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，又可以避免培养基表面的水分过快地挥发，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落计数都可以使用固体培养基，D正确。
2．(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是______________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是_______________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过__________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
解析：(1)蛋白胨中含有碳元素和氮元素，可为细菌生长提供碳源和氮源，葡萄糖只能提供碳源，NaNO3只能提供氮源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH不同，制备培养基时要根据所培养细菌种类的不同来调节pH。硝化细菌是自养生物，可通过化能合成作用利用空气中的CO2合成有机物，所以在没有碳源的培养基上也能生长。(2)用平板培养细菌时，一般将平板倒置，防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。(3)在一定的培养条件下，不同微生物表现出各自稳定的菌落特征，因此研究人员可根据菌落的这些特征初步区分微生物的种类。(4)灭菌可杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。使用后的培养基丢弃前要进行灭菌处理，防止其中的微生物感染操作者或污染环境。
答案：(1)蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同　能够　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)倒置　(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征　(4)灭菌
3．(2019·全国卷Ⅰ节选)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是______________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会__________，其原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供______________和________________。
解析：(1)Ⅰ号培养基中含有牛肉膏蛋白胨和有机物X等，其中X仅含有C、H两种元素，故为微生物提供氮源的是牛肉膏蛋白胨。Ⅱ、Ⅲ号培养基中除无机盐外，还含有有机物X，故为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因Ⅱ号液体培养基中的有机碳源只有X，故培养一段时间后，不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖，故不能降解X的细菌比例会下降。(3)能高效降解X的细菌能将X代谢为丙酮酸，丙酮酸在有氧条件下被降解时能释放出大量能量，故丙酮酸可为该细菌的生长提供能量。丙酮酸还可以为该细菌中其他物质的合成提供原料。
答案：(1)牛肉膏蛋白胨　X　(2)下降　不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
(3)能量　合成其他物质的原料