【学案】第1章 发酵工程：第2节第2课时 微生物的选择培养和计数（word版含解析）
文档属性
| 名称 | 【学案】第1章 发酵工程：第2节第2课时 微生物的选择培养和计数（word版含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 432.4KB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-03-14 09:01:30 | ||
图片预览
文档简介
发酵工程：
第2节 微生物的培养技术及应用 第2课时 微生物的选择培养和计数
学有目标 ——新课程标准必明 记在平时——核心语句必背
1.阐述选择培养的原理。 2．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 3．概述测定微生物数量的方法。 1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目少。 4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
[理清主干知识]
一、选择培养基
1．微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
二、微生物的选择培养
―→―→―→
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)注意事项
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。
③在同一稀释度下，应至少对个平板进行重复计数，然后求出平均值。
④统计的菌落数往往比活菌的实际数目。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2．测定微生物数量的另一种常用方法：显微镜直接计数法。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．实验设计
(1)土壤取样：铲去表层土，在距地表3～8 cm的土壤层取样。
(2)样品的稀释：测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
[诊断自学效果]
1．判断下列叙述的正误
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)
(2)稀释涂布平板法既能分离细菌，也能对细菌进行计数(√)
(3)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)
(4)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√)
2．(2020·东营一模)某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为 CO2和 NH3供植物吸收和利用，但分解产物 CO2不能为该菌提供营养。 下列关于配制用于分离这一菌种的选择培养基的成分，符合要求的是( )
A．仅尿素 B．尿素＋葡萄糖
C．仅葡萄糖 D．牛肉膏蛋白胨
解析：选B 根据题意“某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为 CO2和 NH3供植物吸收和利用，但分解产物 CO2不能为该菌提供营养”可知，该土壤细菌是异养型微生物，需要含碳有机物作为碳源，以尿素作为氮源。
3．(2020·济南期末)下列关于菌种计数方法的叙述，错误的是( )
A．当样品的稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落
B．应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果
解析：选C 利用稀释涂布平板法计数时，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，A正确；计数时应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据，B正确；为了保证结果准确，一般采用菌落数为30～300的平板进行计数，C错误；在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果，D正确。
4．(2020·广州期末)下列有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．其关键是防止杂菌污染，保证培养物的纯度
C．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
D．结果都是在培养基表面形成由单个细胞增殖而来的单个菌落
解析：选D 稀释涂布平板法接种时，首先将菌液进行一系列的梯度稀释，A正确；其关键是防止杂菌污染，保证培养物的纯度，B正确；然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，C正确；在不同稀释度的菌液接种后，只有在一定的稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞，从而能够在培养基表面形成由单个细胞增殖而来的单个菌落，D错误。
[在探究中学明]
1．如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方应该选择下面的哪种设计？该培养基与普通培养基有哪些相同点和不同点？
选项 尿素 琼脂 葡萄糖 硝酸盐、磷酸盐 水
① ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
② － － － － ＋
③ ＋ ＋ ＋ － ＋
④ ＋ － － ＋ ＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
提示：选③。该培养基与普通培养基的共同点是都需要有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质，不同点是该培养基是以尿素为唯一氮源。
2．下面是样品稀释的流程示意图，据图填空：
(1)将10 g土样加入盛有90_mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，样品就被稀释了1×101倍。
(2)取1 mL上清液加入盛有 mL无菌水的试管中，混合均匀，样品就被稀释了1×102倍。
(3)依次等比稀释，直到完成最后一支试管的稀释。
3．下图是涂布平板操作的示意图，用字母和箭头表示涂布平板操作的正确步骤：
提示：a→b→c→d。
4．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
[在深化中提能]
1．选择培养基与鉴别培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色)
2．平板划线法和稀释涂布平板法的区别
比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板操作
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点 可根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
平板示意图
3．两种微生物计数方法的比较
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法 (显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
(2020·宜昌期末)如表是某大肠杆菌的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。
成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 伊红美蓝 琼脂
含量/g 10.0 5.0 5.0 2.0 0.2 12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)培养基常用的灭菌方法是________________。
(2)若根据用途划分，该培养基属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基，若要用上述培养基来筛选土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必须怎样更改？________________，指示剂可用____________代替。
(3)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是________________和____________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的________，其中，________(填“图1”或“图2”)所用的接种方法可用来对活菌进行计数。
(4)一位同学在用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________________，应当怎样操作才可以避免此种现象？
________________________________________________________________________。
[解析] (1)培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。(2)分析表格可知，该培养基加入伊红美蓝作指示剂，属于鉴别培养基；筛选尿素分解菌需要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基，因此要将该配方中的蛋白胨改为尿素，并使用酚红指示剂。(3)由图可知，图1菌落均匀分布，采用的接种方法是稀释涂布平板法，图2采用的接种方法是平板划线法，两种方法接种后在培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的菌落。测定微生物数目的方法是稀释涂布平板法和显微镜计数法。(4)一位同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高，为避免此种现象，应对菌液进行梯度稀释(或加大稀释倍数)。
[答案] (1)高压蒸汽灭菌法 (2)鉴别 将蛋白胨改成尿素 酚红指示剂 (3)稀释涂布平板法 平板划线法 菌落 图1 (4)菌液浓度过高 对菌液进行梯度稀释(或加大稀释倍数)
[在应用中落实]
1．(2020·无锡期末)下列关于稀释涂布平板法相关操作的叙述，错误的是( )
A．将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中消毒
B．涂布前取不超过0.1 mL的菌液滴加到培养基表面
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽即可进行涂布
D．用涂布器将菌液涂布在培养基表面时可转动培养皿使涂布均匀
解析：选C 进行涂布平板操作前，要对涂布器进行灭菌，一般的做法是先将涂布器浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，A正确；涂布平板时，取不超过0.1 mL的菌液，滴加到培养基表面，B正确；将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后冷却再进行涂布，C错误；涂布时，用涂布器将菌液涂布在培养基表面时可转动培养皿使涂布均匀，D正确。
2．下面是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，相关叙述正确的是( )
A．图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B．图乙只适合分离微生物而不适合对微生物进行计数
C．图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D．图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
解析：选B 根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不相同，A错误；图乙是平板划线法接种后的结果，只适合分离微生物而不适合对微生物进行计数，B正确；稀释涂布平板法接种使用涂布器，平板划线法接种使用接种环，C错误；图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。
[在探究中学明]
1．分析下表所示培养基的配方，回答下列问题：
成分 含量 成分 含量
KH2PO4 1.4 g 葡萄糖 10.0 g
Na2HPO4 2.1 g 尿素 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.2 g 琼脂 15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的物质是葡萄糖，提供氮源的物质是尿素。
(2)该培养基是否具有选择作用？为什么？
提示：是。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，本培养基以尿素为唯一氮源，可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。
2．下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图，请分析：
(1)测定土壤中细菌的数量，一般选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布平板？测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
提示：测定土壤中细菌的数量，一般选择用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。不同，因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
(2)第一次实验可以选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布平板？第一次实验时为什么要将稀释范围放宽一些？
提示：第一次实验时可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上进行培养。为了确保能从中选出菌落数在30～300之间的平板进行计数。
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
[在深化中提能]
1．分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上最终有30～300个菌落，细菌一般为104、105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为102、103、104倍的稀释液。
(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板进行重新制作。
(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。
(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。
2．结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
(2020·杭州期中)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图，下列有关叙述错误的是( )
A．在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌
B．步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
C．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
D．步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
[解析] 在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌，A正确；要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨都能提供氮源，因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏蛋白胨，B错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，C正确；步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落，D正确。
[答案] B
[在应用中落实]
1．(2020·潍坊期末)某生物兴趣小组设计实验并成功地从土壤中筛选出能高效分解尿素的细菌(目的菌)。下列关于该实验的叙述，错误的是( )
A．培养基中的碳源与培养硝化细菌的培养基中的碳源相同
B．筛选目的菌时，菌液应稀释后再涂布
C．该实验需要设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染
D．培养基中若加入酚红，目的菌形成的菌落周围的培养基将变红
解析：选A 分解尿素的细菌是异养型生物，培养该微生物所需碳源为有机碳源，而硝化细菌属于自养型生物，其所需碳源为无机碳源，A错误；筛选目的菌时，菌液应稀释后再涂布，B正确；该实验需要设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，C正确；培养基中若加入酚红，目的菌形成的菌落周围的培养基将变红，D正确。
2．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是( )
A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数理论上可能是5号的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的活菌数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
解析：选B 3号试管中菌落稀释倍数是104倍；4号试管的稀释倍数比5号低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的活菌数为(168＋175＋167)÷3×106×10÷10＝1.7×108(个)；通过稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细胞长成一个菌落的情况，故该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低。
[课堂巩固落实]
1．(2019·北京高考)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种 菌落直径：C(mm) 透明圈直径：H(mm) H/C
细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
有关本实验的叙述，错误的是( )
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
解析：选C 微生物的培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等，A正确；筛选分解淀粉的细菌时，实验流程为取样→梯度稀释→样品涂布到鉴别分解淀粉的细菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落，B正确；由题意可知，淀粉被分解后经稀碘液处理才能出现透明圈，淀粉分解需要淀粉酶的催化，图中两种细菌都出现了以菌落为中心的透明圈，说明以上两种细菌均能将淀粉酶分泌到细胞外来发挥作用，C错误；透明圈是细菌分解淀粉得到的，H表示透明圈直径，C表示菌落直径，因此H/C值可以反映两种细菌分解淀粉能力的差异，即H/C值越大，细菌分解淀粉的能力越强，D正确。
2．(2019·全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是__________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是____________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即__________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_________________________。
解析：(1)物质W是一种含氮有机物，要分离能够降解物质W的细菌，需用以物质W为唯一氮源的选择培养基进行筛选。(2)由题图可知，甲菌落周围没有透明圈，说明甲菌不能降解物质W，乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解物质W，若要得到目标菌，应选择乙菌落进一步纯化。(3)要鉴定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，则培养基中不能添加氮源，所以将甲、乙菌分别接种在无氮源的培养基上(其他条件相同且适宜)，若细菌能生长，则说明细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验目的是比较天然酶和酶E降解物质W的能力，做实验时要设计空白对照实验，所以C处应滴加缓冲液。②若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解物质W；A、B处透明圈的出现说明物质W被降解，若两个透明圈直径大小相近，则说明酶E与天然酶降解物质W的能力相近。
答案：(1)W (2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W (3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源 (4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
3．(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有__________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉水解成麦芽糖，淀粉遇碘液变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
答案：(1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸 (3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
第2节 微生物的培养技术及应用 第2课时 微生物的选择培养和计数
学有目标 ——新课程标准必明 记在平时——核心语句必背
1.阐述选择培养的原理。 2．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 3．概述测定微生物数量的方法。 1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目少。 4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
[理清主干知识]
一、选择培养基
1．微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
二、微生物的选择培养
―→―→―→
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)注意事项
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。
③在同一稀释度下，应至少对个平板进行重复计数，然后求出平均值。
④统计的菌落数往往比活菌的实际数目。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2．测定微生物数量的另一种常用方法：显微镜直接计数法。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．实验设计
(1)土壤取样：铲去表层土，在距地表3～8 cm的土壤层取样。
(2)样品的稀释：测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
[诊断自学效果]
1．判断下列叙述的正误
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)
(2)稀释涂布平板法既能分离细菌，也能对细菌进行计数(√)
(3)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)
(4)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√)
2．(2020·东营一模)某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为 CO2和 NH3供植物吸收和利用，但分解产物 CO2不能为该菌提供营养。 下列关于配制用于分离这一菌种的选择培养基的成分，符合要求的是( )
A．仅尿素 B．尿素＋葡萄糖
C．仅葡萄糖 D．牛肉膏蛋白胨
解析：选B 根据题意“某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为 CO2和 NH3供植物吸收和利用，但分解产物 CO2不能为该菌提供营养”可知，该土壤细菌是异养型微生物，需要含碳有机物作为碳源，以尿素作为氮源。
3．(2020·济南期末)下列关于菌种计数方法的叙述，错误的是( )
A．当样品的稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落
B．应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果
解析：选C 利用稀释涂布平板法计数时，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，A正确；计数时应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据，B正确；为了保证结果准确，一般采用菌落数为30～300的平板进行计数，C错误；在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果，D正确。
4．(2020·广州期末)下列有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．其关键是防止杂菌污染，保证培养物的纯度
C．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
D．结果都是在培养基表面形成由单个细胞增殖而来的单个菌落
解析：选D 稀释涂布平板法接种时，首先将菌液进行一系列的梯度稀释，A正确；其关键是防止杂菌污染，保证培养物的纯度，B正确；然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，C正确；在不同稀释度的菌液接种后，只有在一定的稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞，从而能够在培养基表面形成由单个细胞增殖而来的单个菌落，D错误。
[在探究中学明]
1．如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方应该选择下面的哪种设计？该培养基与普通培养基有哪些相同点和不同点？
选项 尿素 琼脂 葡萄糖 硝酸盐、磷酸盐 水
① ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
② － － － － ＋
③ ＋ ＋ ＋ － ＋
④ ＋ － － ＋ ＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
提示：选③。该培养基与普通培养基的共同点是都需要有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质，不同点是该培养基是以尿素为唯一氮源。
2．下面是样品稀释的流程示意图，据图填空：
(1)将10 g土样加入盛有90_mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，样品就被稀释了1×101倍。
(2)取1 mL上清液加入盛有 mL无菌水的试管中，混合均匀，样品就被稀释了1×102倍。
(3)依次等比稀释，直到完成最后一支试管的稀释。
3．下图是涂布平板操作的示意图，用字母和箭头表示涂布平板操作的正确步骤：
提示：a→b→c→d。
4．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
[在深化中提能]
1．选择培养基与鉴别培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色)
2．平板划线法和稀释涂布平板法的区别
比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板操作
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点 可根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
平板示意图
3．两种微生物计数方法的比较
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法 (显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
(2020·宜昌期末)如表是某大肠杆菌的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。
成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 伊红美蓝 琼脂
含量/g 10.0 5.0 5.0 2.0 0.2 12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)培养基常用的灭菌方法是________________。
(2)若根据用途划分，该培养基属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基，若要用上述培养基来筛选土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必须怎样更改？________________，指示剂可用____________代替。
(3)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是________________和____________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的________，其中，________(填“图1”或“图2”)所用的接种方法可用来对活菌进行计数。
(4)一位同学在用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________________，应当怎样操作才可以避免此种现象？
________________________________________________________________________。
[解析] (1)培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。(2)分析表格可知，该培养基加入伊红美蓝作指示剂，属于鉴别培养基；筛选尿素分解菌需要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基，因此要将该配方中的蛋白胨改为尿素，并使用酚红指示剂。(3)由图可知，图1菌落均匀分布，采用的接种方法是稀释涂布平板法，图2采用的接种方法是平板划线法，两种方法接种后在培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的菌落。测定微生物数目的方法是稀释涂布平板法和显微镜计数法。(4)一位同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高，为避免此种现象，应对菌液进行梯度稀释(或加大稀释倍数)。
[答案] (1)高压蒸汽灭菌法 (2)鉴别 将蛋白胨改成尿素 酚红指示剂 (3)稀释涂布平板法 平板划线法 菌落 图1 (4)菌液浓度过高 对菌液进行梯度稀释(或加大稀释倍数)
[在应用中落实]
1．(2020·无锡期末)下列关于稀释涂布平板法相关操作的叙述，错误的是( )
A．将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中消毒
B．涂布前取不超过0.1 mL的菌液滴加到培养基表面
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽即可进行涂布
D．用涂布器将菌液涂布在培养基表面时可转动培养皿使涂布均匀
解析：选C 进行涂布平板操作前，要对涂布器进行灭菌，一般的做法是先将涂布器浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，A正确；涂布平板时，取不超过0.1 mL的菌液，滴加到培养基表面，B正确；将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后冷却再进行涂布，C错误；涂布时，用涂布器将菌液涂布在培养基表面时可转动培养皿使涂布均匀，D正确。
2．下面是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，相关叙述正确的是( )
A．图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B．图乙只适合分离微生物而不适合对微生物进行计数
C．图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D．图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
解析：选B 根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不相同，A错误；图乙是平板划线法接种后的结果，只适合分离微生物而不适合对微生物进行计数，B正确；稀释涂布平板法接种使用涂布器，平板划线法接种使用接种环，C错误；图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。
[在探究中学明]
1．分析下表所示培养基的配方，回答下列问题：
成分 含量 成分 含量
KH2PO4 1.4 g 葡萄糖 10.0 g
Na2HPO4 2.1 g 尿素 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.2 g 琼脂 15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的物质是葡萄糖，提供氮源的物质是尿素。
(2)该培养基是否具有选择作用？为什么？
提示：是。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，本培养基以尿素为唯一氮源，可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。
2．下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图，请分析：
(1)测定土壤中细菌的数量，一般选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布平板？测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
提示：测定土壤中细菌的数量，一般选择用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。不同，因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
(2)第一次实验可以选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布平板？第一次实验时为什么要将稀释范围放宽一些？
提示：第一次实验时可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上进行培养。为了确保能从中选出菌落数在30～300之间的平板进行计数。
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
[在深化中提能]
1．分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上最终有30～300个菌落，细菌一般为104、105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为102、103、104倍的稀释液。
(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板进行重新制作。
(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。
(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。
2．结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
(2020·杭州期中)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图，下列有关叙述错误的是( )
A．在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌
B．步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
C．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
D．步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
[解析] 在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌，A正确；要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨都能提供氮源，因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏蛋白胨，B错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，C正确；步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落，D正确。
[答案] B
[在应用中落实]
1．(2020·潍坊期末)某生物兴趣小组设计实验并成功地从土壤中筛选出能高效分解尿素的细菌(目的菌)。下列关于该实验的叙述，错误的是( )
A．培养基中的碳源与培养硝化细菌的培养基中的碳源相同
B．筛选目的菌时，菌液应稀释后再涂布
C．该实验需要设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染
D．培养基中若加入酚红，目的菌形成的菌落周围的培养基将变红
解析：选A 分解尿素的细菌是异养型生物，培养该微生物所需碳源为有机碳源，而硝化细菌属于自养型生物，其所需碳源为无机碳源，A错误；筛选目的菌时，菌液应稀释后再涂布，B正确；该实验需要设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，C正确；培养基中若加入酚红，目的菌形成的菌落周围的培养基将变红，D正确。
2．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是( )
A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数理论上可能是5号的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的活菌数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
解析：选B 3号试管中菌落稀释倍数是104倍；4号试管的稀释倍数比5号低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的活菌数为(168＋175＋167)÷3×106×10÷10＝1.7×108(个)；通过稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细胞长成一个菌落的情况，故该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低。
[课堂巩固落实]
1．(2019·北京高考)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种 菌落直径：C(mm) 透明圈直径：H(mm) H/C
细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
有关本实验的叙述，错误的是( )
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
解析：选C 微生物的培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等，A正确；筛选分解淀粉的细菌时，实验流程为取样→梯度稀释→样品涂布到鉴别分解淀粉的细菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落，B正确；由题意可知，淀粉被分解后经稀碘液处理才能出现透明圈，淀粉分解需要淀粉酶的催化，图中两种细菌都出现了以菌落为中心的透明圈，说明以上两种细菌均能将淀粉酶分泌到细胞外来发挥作用，C错误；透明圈是细菌分解淀粉得到的，H表示透明圈直径，C表示菌落直径，因此H/C值可以反映两种细菌分解淀粉能力的差异，即H/C值越大，细菌分解淀粉的能力越强，D正确。
2．(2019·全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是__________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是____________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即__________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_________________________。
解析：(1)物质W是一种含氮有机物，要分离能够降解物质W的细菌，需用以物质W为唯一氮源的选择培养基进行筛选。(2)由题图可知，甲菌落周围没有透明圈，说明甲菌不能降解物质W，乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解物质W，若要得到目标菌，应选择乙菌落进一步纯化。(3)要鉴定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，则培养基中不能添加氮源，所以将甲、乙菌分别接种在无氮源的培养基上(其他条件相同且适宜)，若细菌能生长，则说明细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验目的是比较天然酶和酶E降解物质W的能力，做实验时要设计空白对照实验，所以C处应滴加缓冲液。②若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解物质W；A、B处透明圈的出现说明物质W被降解，若两个透明圈直径大小相近，则说明酶E与天然酶降解物质W的能力相近。
答案：(1)W (2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W (3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源 (4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
3．(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有__________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉水解成麦芽糖，淀粉遇碘液变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
答案：(1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸 (3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差