第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序(共98张PPT)

(共98张PPT)
第3章　基因工程
第2节　基因工程的基本操作程序
课标要点 学法指导
1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 2．利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定或运用软件进行虚拟PCR实验 1．掌握目的基因的筛选与获取方法(科学思维)
2．学会基因表达载体构建的方法和要求(生命观念)
3．理解目的基因导入受体细胞的具体过程(科学思维)
4．掌握目的基因检测与鉴定的方法(社会责任)
5．掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法(科学探究)
知识导图


课前·新知导学
　　　　　目的基因的筛选与获取
1．目的基因
用于改变受体细胞性状或获得_________________等的基因，它可以编码___________。
2．筛选目的基因的依据
根据目的基因的已知______________进行筛选是较为有效的方法。
预期表达产物　
蛋白质　
结构和功能　
3．利用PCR技术获取和扩增目的基因
(1)PCR：是一项根据________________的原理，在体外提供参与DNA复制的__________和___________，对目的基因的______________进行大量复制的技术。
(2)PCR反应的条件：需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供____________、________、________________、__________________ ________；同时需要控制温度。
DNA半保留复制　
各种组分　
反应条件　
核苷酸序列　
DNA模板　
引物　
脱氧核苷酸　
耐高温的DNA聚
合酶　　
(3)过程：目的基因DNA受热变性后形成__________；________与单链相应互补序列结合；以单链DNA为模板，在________________的作用下进行延伸，如此循环多次。每次循环一般可以分为__________、_________和_______三步。
(4)结果：每次循环后目的基因的量增加________，即成________形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
(5)PCR产物鉴定方法：采用_______________来鉴定PCR的产物。
4．目的基因也可以通过构建____________获得
单链　
引物　
DNA聚合酶　
变性　
复性　
延伸　
一倍　
指数　
琼脂糖凝胶电泳　
基因文库　
PCR过程需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶又具有什么特点呢？
微思考
【答案】PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶。所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。
　　　下列属于PCR技术的条件的是 (　　)
①单链的脱氧核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段　③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制性内切核酸酶
A．①②③⑤　　　　 B．①②③⑥
C．①②③⑤⑦ D．①②④⑤⑦
【答案】B
【解析】 PCR技术需要一对引物，即一对单链的脱氧核苷酸序列引物，①正确；PCR技术需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正确；需要脱氧核苷酸作为原料，③正确；核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④错误；采用PCR合成DNA时，不需要DNA连接酶，而需要DNA聚合酶，⑤错误，⑥正确；体外合成DNA时，不需要限制性内切核酸酶，⑦错误。故B符合题意。
　　　　　基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．基因表达载体的功能
使目的基因在受体细胞中____________，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够________和发挥作用。
稳定存在　
表达　
2．表达载体的组成
目的基因、________、________、标记基因等。
(1)启动子：位于基因的________的一段有特殊序列结构的DNA片段，是____________识别和结合的部位，能驱动基因________产生所需的mRNA。
(2)终止子：位于基因的________的一段有特殊序列结构的DNA片段，终止________。
启动子　
终止子　
上游　
RNA聚合酶　
转录　
下游　
转录　
3．基因表达载体的构建过程
(1)用一定的_________切割载体，使它出现一个切口。
(2)用__________或能产生相同末端的限制酶切割含__________的DNA片段。
(3)利用_____________将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。
限制酶　
同一种　
目的基因　
DNA连接酶　
构建重组质粒时只能用同一种限制酶切割目的基因和载体吗？
微思考
【答案】切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果两种不同的限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因和载体也可以连接起来。
　　　下列选项中不是表达载体必要的组成成分的是 (　　)
A．目的基因　　　 B．启动子
C．终止子 D．抗青霉素基因
【答案】D
【解析】基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等，A、B、C正确；抗青霉素基因可以作为标记基因，但标记基因也可以是其他的基因，所以抗青霉素基因不是基因表达载体所必需的，D错误。
　　　　　将目的基因导入受体细胞
1．转化的概念
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内__________________的过程。
2．转化的方法
(1)花粉管通道法：可以用微量注射器将含____________的DNA溶液直接注入________中；也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去________，将DNA溶液滴加在__________切面上，使目的基因借助__________通道进入胚囊。
维持稳定和表达　
目的基因　
子房　
柱头　
花柱　
花粉管　
(2)农杆菌转化法：
①农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有______质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的__________转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的______________上。
②过程：将目的基因插入Ti质粒的__________中，通过农杆菌的__________，就可以使____________进入植物细胞。
Ti　
T－DNA　
染色体DNA　
T－DNA　
转化作用　
目的基因　
(3)将目的基因导入动物细胞时可以采用__________将目的基因注入动物的受精卵。将目的基因导入原核细胞时一般用________处理受体细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中____________的生理状态，然后再将____________________导入其中。
显微注射　
Ca2＋　
DNA分子　
重组的基因表达载体　
植物基因工程的受体细胞是体细胞还是受精卵？为什么？
微思考
【答案】体细胞和受精卵都可以，因为植物细胞的体细胞和受精卵都具有全能性，都可以发育成完整个体。
　　　农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，目的基因的最终位置是 (　　)
A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体上
C．裸露细胞核中 D．存在细胞质中
【答案】B
【解析】农杆菌的Ti质粒上的T－DNA片段具有转移作用，能整合到细胞染色体DNA上。将目的基因插入到T－DNA片段中，能利用T－DNA片段的特性，将目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。
　　　　　目的基因的检测与鉴定
1．分子水平的检测
包括通过________等技术检测棉花的______________上是否插入了Bt基因(目的基因)或检测Bt基因(目的基因)是否________________；从转基因生物体中提取蛋白质，用相应的抗体进行__________________，检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质。
2．个体生物学水平的鉴定
可以通过抗虫接种实验检测Bt基因是否赋予了棉花____________以及_______________。
PCR　
染色体DNA　
转录出mRNA　
抗原－抗体杂交　
抗虫特性　
抗性的程度　
检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简单的方法是什么？
微思考
【答案】用叶片直接饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
　　　目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 (　　)
①检测受体细胞是否含有目的基因　②检测受体细胞是否含有致病基因　③检测目的基因是否转录出mRNA　④检测目的基因是否翻译出蛋白质
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
【答案】C
【解析】目的基因导入受体细胞后，要检测其是否进入了受体细胞及在受体细胞中是否进行了表达，所以要进行的检测和鉴定包括检测受体细胞是否含有目的基因，①正确；检测目的基因是否转录出mRNA，③正确；检测目的基因是否翻译出蛋白质，④正确；不需要检测受体细胞中是否含有致病基因，②错误。故C符合题意。
　　　　　DNA片段的扩增与电泳鉴定
1．实验原理
(1)DNA片段扩增的原理：利用________可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了_________________原理，通过调节温度来控制_______________________。
PCR　
DNA的热变性　
DNA双链的解聚与结合　
(2)DNA片段鉴定的原理：
①DNA分子具有可解离的____________，在一定的pH下，这些基团可以带上__________________。在________的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR的产物DNA片段一般通过_________________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与______________、__________________和________等有关。
③在凝胶中DNA分子通过_______，可以在波长为_________的紫外灯下被检测出来。
基团　
正电荷或负电荷　
电场　
相反　
琼脂糖凝胶电泳　
凝胶的浓度　
DNA分子的大小　
构象　
染色　
300 nm　
2．方法步骤
(1)PCR扩增DNA片段：
①移液：用_______________把PCR配方中的各种成分加入微量离心管中。
②混合离心：将微量离心管放入离心机，离心约10 s，使反应液集中在______________。
③反应：将装有反应液的微量离心管放入___________中进行PCR反应。
微量移液器　
管的底部　
PCR仪　
(2)琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段：
①配制琼脂糖溶液：用______________配制琼脂糖溶液。琼脂糖熔化稍冷却后，加入适量的___________混匀。
②制作加样孔：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，插入合适大小的梳子，以形成__________。
③把凝胶放入电泳槽：凝胶溶液完全凝固后，拔出梳子，取出凝胶放入_________内。将电泳缓冲液加入电泳槽内，电泳缓冲液________凝胶1 mm为宜。
电泳缓冲液　
核酸染料　
加样孔　
电泳槽　
没过　
④加样：将扩增的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的________，同时用标准参照物作对照点样。
⑤电泳：接通电源进行电泳，待指示剂前沿迁移到接近__________时，停止电泳。
⑥观察：取出凝胶置于________下观察和照相。
加样孔　
凝胶边缘　
紫外灯　
PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水在使用前要进行灭菌，灭菌的方法有哪些？
微思考
【答案】高压蒸汽灭菌。
　　　使用PCR仪的具体实验操作顺序应为 (　　)
①设计好PCR仪的循环程序　②按照配方准备好各组分　③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分　④进行PCR反应　⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④① B．①⑤③②④
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
【答案】C
【解析】使用PCR仪的操作步骤一般为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)、移液、混合、离心、反应，C正确。
目的基因的筛选、获取
[知识归纳]
1．目的基因筛选的原理
根据目的基因已知的结构和功能进行筛选。
2．目的基因获取的方法
(1)利用PCR技术获取和扩增目的基因。
①PCR技术的原理：DNA半保留复制。
②PCR技术的前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列(便于根据这一序列合成引物)。
③PCR技术的条件分析：
所需条件 在PCR技术中参与的组分
模板 DNA母链
原料 4种脱氧核苷酸
酶 耐高温的DNA聚合酶
引物 一小段能与DNA母链进行配对的短单链核酸
一定的缓冲液 保持反应体系的pH稳定
控制温度 保证DNA复制在体外反复进行
④PCR技术的过程：
a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
b．复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
c．延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
⑤结果：使处于两个引物之间的DNA片段呈指数增长。
(2)通过构建基因文库获取目的基因。
下图是PCR技术扩增的过程，请思考下列问题：
(1)PCR技术是在体外还是在体内进行的？需要哪些条件？
(2)PCR技术在扩增的过程中，子链合成的方向是什么？子链从引物的哪个方向开始延伸？
(3)结合上图，判断图中A、B、C分别代表什么过程？PCR技术扩增的是整个DNA分子吗？
提示：(1)体外；DNA母链作为模板、脱氧核苷酸作为原料、耐高温的DNA聚合酶、引物、缓冲液等。
(2)由图可知，子链合成的方向是5′→3′，子链从引物的3′端开始延伸。
(3)由图可知，A表示变性，B表示复性，C表示延伸；PCR技术扩增的是处于两个引物之间的DNA片段。
【规律总结】目的基因获取方法的选择
条件 方法
不知道目的基因的核苷酸序列 通过构建基因文库获取
知道目的基因的核苷酸序列，且较小 通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成
知道目的基因的一段核苷酸序列，且较大 通过PCR技术扩增目的基因
素养达成：本重难点通过目的基因筛选与获取的方法的学习，培养“生命观念”“科学思维”素养。
[对点精练]
1．以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是 (　　)
A．甲方法可以根据目的基因的结构和功能进行筛选
B．乙方法的c过程表示转录，d过程表示逆转录
C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料
D．乙方法需要逆转录酶参与
【答案】C
【解析】甲方法是某细菌的DNA扩增并用限制酶切割，得到该细菌的多个DNA片段，可以根据目的基因的结构和功能进行筛选，A正确、C错误；乙方法中c为转录，d为逆转录，需要逆转录酶的参与，B、D正确。
2．下列有关PCR技术的叙述正确的是 (　　)
A．每一次扩增必须不断添加DNA序列作为模板
B．反应需要的DNA连接酶必须不断地加进反应当中
C．反应需要的DNA聚合酶必须不断地加进反应当中
D．作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断地加进每一次的扩增当中
【答案】D
【解析】作为模板的DNA序列只要添加一次，起模板作用，A错误；PCR扩增反应过程中不需要DNA连接酶，B错误；反应需要的DNA聚合酶可以反复使用，不需要不断地加进反应当中，C错误；模板链只要加入一次，引物片段必须不断加入，D正确。
[知识归纳]
1．基因表达载体的组成
基因表达载体的构建
2．基因表达载体构建的过程
利用基因工程培育转基因植物，需要构建基因表达载体，下图甲、乙分别表示含有目的基因的DNA片段、质粒，请结合甲、乙两图，回答下列问题：
(1)为什么不直接将目的基因导入受体细胞，而需要构建基因表达载体？
(2)图乙是载体质粒的示意图，除了图中的标记基因外，基因表达载体还有哪些组成？
(3)结合甲、乙两图分析，为了使目的基因与载体连接，应用哪种限制酶进行切割，为什么？能用限制酶Sma Ⅰ吗？
(4)获得目的基因后，用DNA连接酶连接构建基因表达载体时，会出现几种结果？为了防止目的基因与载体反向连接，结合上图分析，可以怎么解决？
提示：(1)游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若构建基因表达载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。
(2)基因表达载体除了标记基因外，还有目的基因、启动子、终止子、复制原点等。
(3)用限制酶PstⅠ，因为目的基因和载体上都有限制酶PstⅠ的识别位点，可以产生相同的黏性末端，便于连接；不能用限制酶SmaⅠ切割目的基因和载体，因为用限制酶SmaⅠ切割目的基因，会破坏目的基因的结构，用限制酶SmaⅠ切割载体，会破坏标记基因，难以进行筛选。
(4)目的基因与载体结合、目的基因与目的基因结合、载体与载体结合，还会出现目的基因与载体反向结合；为了防止目的基因与载体反向连接，可以同时使用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ对目的基因和载体进行切割。
【方法技巧】构建基因表达载体时限制酶的选择
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶的切点应该位于目的基因的两端，不能位于目的基因的内部，否则，会破坏目的基因的结构。
(2)为了便于目的基因与载体连接，常常选用同一种限制酶切割目的基因和载体，这样可以产生相同的黏性末端，有利于连接。
(3)为了防止目的基因和载体的自身环化和随意连接，应使用不同的限制酶切割目的基因和载体，这样目的基因和载体两端的末端不一样，但目的基因和载体上都有一个相同的末端。
2．根据载体的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
(2)载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏标记基因的结构；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
素养达成：本重难点通过学习基因表达载体的组成和构建过程，培养“生命观念”“科学思维”素养。
[对点精练]
1．下列对基因表达载体构建的叙述，不正确的是(　　)
A．需要限制酶和DNA连接酶等特殊工具
B．基因表达载体中有的含有启动子和密码子
C．标记基因不一定是抗生素抗性基因
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
【答案】B
【解析】 基因表达载体是目的基因与载体的结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来，A正确；基因表达载体含有启动子、终止子、标记基因和目的基因，密码子位于mRNA上，B错误；抗生素抗性基因可作为标记基因，但标记基因不都是抗生素抗性基因，C正确；基因表达载体的构建是基因工程的核心，在细胞外进行，使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代并表达和发挥作用，D正确。
2．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作不正确的是 (　　)

A．用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B．重组质粒的构建依赖于碱基互补配对
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．C基因导入受体细胞后，不一定能够成功表达，需要进行进一步检测与鉴定
【答案】C
【解析】分析图示可知：用限制性内切核酸酶EcoRⅠ切割目的基因(花色基因C)和质粒，可使目的基因和质粒产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶将切口连起来从而构建重组质粒，A正确；重组质粒构建时，目的基因的黏性末端和质粒的黏性末端之间的碱基通过碱基互补配对形成氢键，B正确；从图中可以看出，该质粒中只有潮霉素抗性基因，被转化的菊花细胞只对潮霉素有抗性，因此在培养基中添加卡那霉素，不能筛选被转化的菊花细胞，C错误；C基因导入受体细胞后，不一定能够成功表达，需要进行进一步检测与鉴定，D正确。
[知识归纳]
将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
1．将目的基因导入受体细胞的方法
生物类型 方法 受体细胞 过程 特点
转基因 植物 花粉管通道法 受精卵 植物受粉一段时间后剪去柱头→滴加DNA溶液(含目的基因)→目的基因借助花粉管通道进入受体细胞(胚囊)→目的基因表达 我国独创的一种方法
生物类型 方法 受体细胞 过程 特点
转基因 植物 农杆菌转化法 体细胞或受精卵 将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体DNA上→目的基因表达 适用于双子叶植物和裸子植物　　　
转基因 动物　 显微注射法　 受精卵 提纯含目的基因的表达载体→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期发育，移植→获得具有新性状的动物 目的基因导入动物细胞最有效的方法
生物类型 方法 受体细胞 过程 特点
转基因微生物 Ca2＋处理法　 微生物 细胞　 用Ca2＋处理微生物细胞→处于能吸收DNA分子的状态(即感受态细胞)→基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 简便、经济、有效
2．目的基因检测与鉴定方法
类型 检测内容 方法 结果显示
分子水平 的检测　 目的基因是否插入受体细胞DNA上 PCR技术 是否扩增出目的基因　
目的基因是否转录出mRNA PCR技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原－抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间) 是否显示出杂交带　　
个体生物学水平的检测　　 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗性接种实验 是否赋予了预期抗性　
【拓展延伸】实时定量PCR
实时定量PCR (real－time quantitative PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
实时定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶
进行连续反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因，含有质粒载体，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请思考回答下列问题：
(1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞无法被区分，其原因是什么？含有载体和重组质粒的细胞也无法被区分，其原因是什么？在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有什么抗生素的固体培养基？
(2)若利用标记基因筛选出了导入载体的受体细胞，为何还需利用PCR技术确认目的基因是否转入？
提示：(1)二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。还需使用含四环素的培养基。
(2)经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定(具有标记基因)的载体，然而，该载体上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需利用PCR技术检测受体细胞内是否含目的基因。
【规律总结】含有目的基因的受体细胞的筛选
含有目的基因的受体细胞的筛选方法有很多种，下面以抗生素抗性基因作为标记基因进行筛选为例。
(1)原理：将目的基因插入到含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入到某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素基因失活。如上图，目的基因插入到四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌的种类：含有环状目的基因的细菌、含有重组质粒的细菌、含有普通质粒的细菌。
(2)筛选的方法：将转化后的细菌先放在含有氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含普通质粒的细菌，如上图的1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌绒布影印到含有四环素的培养基上，不生长的即为含有重组质粒的菌落，如上图的1、5菌落，最后，可以在含氨苄青霉素的培养基上对照挑取1、5菌落进行培养。
素养达成：本重难点通过学习目的基因导入细胞和目的基因的检测与鉴定方法，培养“科学思维”“科学探究”素养。
[对点精练]
1．采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是 (　　)
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中　②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中　③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养　④将编码毒素蛋白的 DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵
A．①②　　　 B．②③
C．③④　　　 D．①④
【答案】C
【解析】将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中，没有获得目的基因，子代细胞不会有抗虫性状，①错误；将编码毒素蛋白的DNA序列直接注射到棉受精卵中而没有将目的基因与载体结合，这样目的基因是不会被保留下来的，很容易被水解掉，②错误；在植物细胞基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，然后通过植物组织培养技术将植物细胞培养成完整植株，③正确；在植物细胞基因工程中，可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中，然后培育为转基因植株，④正确。故C正确。
2．在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是 (　　)
A．观察害虫吃棉叶是否死亡
B．检测目的基因片段可以通过PCR技术检测是否扩增出目的基因
C．检测目的基因转录形成的mRNA可以先进行逆转录，然后利用PCR技术检测是否扩增出目的基因
D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
【答案】A
【解析】A属于个体生物学水平的鉴定，A错误；B、C是利用PCR技术，检测目的基因及目的基因转录形成的mRNA是否扩增出相应的含目的基因的DNA片段，为分子水平的检测，B、C正确；D为利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带，为分子水平的检测，D正确。
易错易混1：启动子与起始密码子、终止子与终止密码子的区分
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的位置、化学本质和作用各不相同，如下表所示：
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置 基因的上游 基因的下游 mRNA上 mRNA上
化学本质 DNA序列 DNA序列 RNA序列 RNA序列
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因的转录 终止基因 的转录　 蛋白质合成开始的信号(起点)　　 终止蛋白质合成(终点)　　　
例1　下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　)
A．胰岛素基因的起始密码子是一段DNA序列，位于胰岛素基因的首端
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
【解析】起始密码子是mRNA上三个相邻的碱基，是蛋白质翻译的起点，A错误；表达载体的复制启动于复制原点，但胰岛素基因的表达启动于启动子，B错误；借助抗生素抗性基因(标记基因)可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来，C正确；启动子在胰岛素基因的转录中起作用，终止密码子在翻译中起作用，D错误。
错因分析：一是混淆了启动子与起始密码子，终止子与终止密码子的位置、本质和作用；二是对基因的复制起点、转录的起点、翻译的起点理解不清；三是对含有目的基因的受体细胞的筛选方法理解不到位。
易错易混2：农杆菌转化法过程的分析
农杆菌转化法过程中有两次拼接和两次导入。第一次拼接(人工操作)是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA片段上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA片段拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入(人工操作)是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA(即重组质粒)导入受体细胞。
例2　下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，以下相关叙述，正确的是 (　　)
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就一定表现出抗虫性状
D．⑤若表现出抗虫性，则该植株发生的变异是可遗传的
【答案】D
【解析】②重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到④的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上含抗虫基因，说明目的基因已经成功导入，但这不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D正确。
错因分析：一是对基因表达载体构建的过程掌握不熟练，对基因表达载体构建过程中使用的酶的种类识记不清；二是对农杆菌Ti质粒上的T－DNA片段的特性掌握不清，不知道目的基因插入到受体细胞染色体的DNA上依靠的是T－DNA片段的转移作用；三是对目的基因的插入与表达是两回事理解不到位，目的基因插入受体细胞的染色体DNA上，不一定就表达；四是对可遗传变异的含义理解不到位。
解题技巧：实验评价的解题方法
例3　阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，患者脑部大多有β?淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的斑块且患者神经元会发生“过劳死”。淀粉样前体蛋白(APP)的酶切片段被分泌到细胞外发挥功能，其中一段会形成Aβ，因此以往研究更多关注Aβ。然而针对Aβ研发的药物在近年均被证明无效，为寻找阿尔茨海默病的新治疗途径，研究者希望通过实验了解APP其他酶切片段(比如sAPPα)的生理功能。
(1)由于APP蛋白集中表达于神经元突触部位，研究者推测，分泌的sAPPα可能与突触部位细胞表面的______结合，进而影响神经调节。经过筛选，发现sAPPα能与GABABR蛋白结合。为确定sAPPα与GABABR蛋白的结合区域，研究者分别构建了含________、编码GABABR不同亚基的目的基因、一段特殊多肽(HA)的基因以及终止子的________，转入细胞。通过研究发现，sAPPα与特异性受体结合阻止了神经递质的释放，从而抑制了神经元之间信号的传递。
(2)研究者发现sAPPα中一个由17个氨基酸组成的多肽片段(APP 17mer)就具有sAPPα的生理功能。为验证该多肽在生物个体水平是否有效，有人设计了以下实验方案：将同一批正常小鼠分为两组，一组为实验组，一组为对照组。
组别 实验处理 检测
实验组 给小鼠喂食人工合成的该多肽片段(APP 17mer) 分别检测实验组和对照组小鼠海马神经元的电信号
对照组 给小鼠喂食清水 ①请指出该实验方案存在的缺陷：
______________________________________________。
②请改进本实验方案(写出实验组和对照组处理)：
________________________________________。
【答案】(1)受体　启动子　载体
(2)①多肽不可通过喂食方式给药；对照组不应喂食清水
②实验组：需要对小鼠海马区局部直接给药，比如注射、灌流等；对照组：应采用氨基酸种类相同但排列顺序不同的多肽对小鼠给药
审题流程：
第一步　解读题干，获得有用信息
从题干“为寻找阿尔茨海默病的新治疗途径，研究者希望通过实验了解APP其他酶切片段(比如sAPPα)的生理功能”得到实验目的信息：①研究寻找治疗阿尔茨海默病的治疗途径；②通过实验了解APP其他酶切片段的生理功能。
第二步　对接教材和实验分析方法，迁移应用
第(1)题考查基因工程中基因表达载体的构建，基因表达载体的组成包括启动子、终止子、标记基因、目的基因、复制原点等。第(2)小题考查实验方案的评价，实验方案的评价可以从以下几个方面进行：①是否遵循对照实验原则，自变量设置是否合理，因变量确立是否可观，无关变量是否控制得当；
②实验材料、器材和药剂的选择是否合理；③实验条件的设置是否合理；④实验步骤设计是否完整、顺序是否合理、有无违反生物学原理；⑤实验目的是否与实验结果、结论对应；是否先写结果后写结论；探究性实验结果和结论是否讨论全面等。本实验自变量的处理方式和对照实验设置不恰当，药物的化学本质是多肽，不能采用饲喂的方式，对照组饲喂清水不合适。
第三步　结合小题，逐个突破
(1)作为信号分子的sAPPα可能通过与突触表面的特异性受体结合来影响神经调节。研究发现，sAPPα是与GABABR蛋白结合，而GABABR蛋白含有若干亚基，为了确定结合的具体部位，需要构建含有编码GABABR不同亚基的目的基因的基因表达载体，基因表达载体应含有启动子、终止子及一段特殊多肽(HA)的基因，并将基因表达载体导入受体细胞中。
(2)APP 17mer是多肽，不能口服，会被水解酶水解成氨基酸，不能发挥作用，可以采用注射法；为了排除无关变量的影响，对照组不应该喂清水，而应该注射氨基酸种类相同但排列顺序不同的多肽，然后分别检测实验组和对照组小鼠海马神经元的电信号变化。
“五看法”评价实验设计小结
小练·素养达成
1．基因工程的核心是 (　　)
A．目的基因的筛选与获取
B．基因表达载体的构建
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的检测与鉴定
【答案】B
2．下列不属于获取目的基因的方法的是 (　　)
A．利用DNA连接酶复制目的基因
B．利用DNA聚合酶复制目的基因
C．从基因文库中获取目的基因
D．利用PCR技术扩增目的基因
【答案】A
【解析】DNA连接酶用于连接两个DNA片段，不是获取目的基因的方法，A错误；用DNA聚合酶复制目的基因是获取目的基因的方法之一，B正确；可以从基因文库中获取目的基因，C正确；获取目的基因的方法之一是PCR技术扩增目的基因，D正确。
3．不属于目的基因与载体结合过程的是 (　　)
A．用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端
B．用同种限制酶切割目的基因，露出黏性末端
C．将切下的目的基因插入质粒的切口处
D．将重组DNA引入受体细胞中进行扩增
【答案】D
【解析】目的基因与载体结合的过程中， 用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端，A正确；为了便于连接，用同种限制酶切割目的基因，露出和载体相同的黏性末端，B正确；将切下的目的基因用DNA连接酶插入质粒的切口处，形成重组DNA分子，C正确；将重组DNA引入受体细胞中进行扩增，这属于将目的基因导入受体细胞的步骤，D错误。
4．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是 (　　)
A．显微注射法是培育转基因动物最常用的方法
B．显微注射法是将含有目的基因的载体直接注入体细胞中
C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
【答案】B
【解析】显微注射法是培育转基因动物最常用的方法，A正确；由于动物的体细胞不具有全能性，所以转基因动物是将含有目的基因的载体直接注入受精卵，B错误；大肠杆菌最常用的转化方法是用Ca2＋处理受体细胞，使之转化为容易吸收周围DNA分子的状态，C正确；农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，D正确。
5．下列有关基因工程基本操作程序的叙述正确的是 (　　)
A．基因工程的第二步不涉及碱基互补配对原则
B．人们常用转化法将目的基因导入大肠杆菌细胞
C．常用分裂能力较强的动物细胞作为基因工程的受体细胞
D．若从转基因生物中提取的mRNA可与目的基因形成杂交带，说明该目的基因已表达
【答案】B
【解析】基因工程的第二步是构建基因表达载体，该过程中涉及碱基互补配对原则，如用DNA连接酶连接具有相同黏性末端的DNA片段时涉及碱基互补配对原则，A错误； 人们常用转化法将目的基因导入大肠杆菌细胞，B正确； 动物细胞一般使用受精卵作为基因工程的受体细胞，C错误； 若从转基因生物中提取的mRNA可与目的基因形成杂交带，说明该目的基因已转录，而基因的表达包括转录和翻译两个过程，D错误。