2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3-3.1重组DNA技术的基本工具(含DNA粗提取)课件(共35张PPT)
文档属性
| 名称 | 2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3-3.1重组DNA技术的基本工具(含DNA粗提取)课件(共35张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 43.1MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-03-22 08:56:09 | ||
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文档简介
(共35张PPT)
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
科技探索之路
基因工程的诞生和发展
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因重组
②操作水平：
③操作结果：
①操作原理：
DNA分子水平
定向的改造生物遗传性状，获得人们所需的生物类型和生物产品
基因工程
人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础是？
（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。
（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。
（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。
（4）遗传信息的传递都遵循 。
DNA
中心法则
基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
基因工程
第3章 基因工程
重组DNA技术的基本工具
01
基因工程的基本操作程序
02
基因工程的应用
03
蛋白质工程的原理和应用
04
为了棉花姓“中国”
1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害以迅雷不及掩耳之势吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；
国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。
1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种——中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；
2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种——中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性;
2017年10月13日,农业部种子管理局副局长吴晓玲在回答媒体提问时表示, 目前中国自主选育的转基因棉花品种市场份额占到95%以上, 国外品种不到5%。
从社会中来
苏云金芽孢杆菌
提取
抗虫基因
普通棉花(无抗虫特性)
棉花细胞(含抗虫基因)
与运载体DNA拼接，导入
棉花植株(有抗虫特性)
表达 抗虫基因
（BT毒蛋白基因）
如何获得抗虫棉？需要什么工具？
3.1 重组DNA技术的基本工具
（三）分子运输车---载体
（一）分子手术刀---限制性内切核酸酶
（二）分子缝合针---DNA连接酶
“手术刀”
“缝合针”
“运输车”
1.来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来
2.功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
3.作用部位：磷酸二酯键，限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
4.切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端
限制性内切核酸酶
一
磷酸二酯键
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA
微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期的演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
限制性内切核酸酶
一
思考讨论1：仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制性内切核酸酶
一
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
限制性内切核酸酶
一
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
G
G
C T T A A
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
DNA连接酶——“分子缝合针”
2.分类：
二
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
1.作用:
类型 来源 功能 相同点 差别
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
与DNA聚合酶的比较：
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
1.作用: ① ．
② ．
2.作为运载体需具备的条件:
3.种类
将目的基因转移到受体细胞中去
利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
②有1个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
③具有标记基因，便于进行筛选
④对受体细胞无害
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
DNA分子复制的起点
有一个或多个限制酶酶切位点
有标记基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
①抗生素的抗性基因
②荧光蛋白基因
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
噬菌体或动植物病毒作为运载体的原理是：
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位： 磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
2.实验原理：
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
1.实验设计思路：
四
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
3.方法步骤
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
3.选材：
注意：
4.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
5.方法步骤
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
析出DNA
DNA的鉴定
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
方法步骤 （视频）
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
注意事项
1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
3．加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
4．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
5．预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
刑侦破案
拓展：DNA提取的应用
基因组测序
插入人胰岛素基因的大肠杆菌
基因工程
亲子鉴定
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
结果分析与评价
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
练习与应用
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
提示：迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
练习与应用
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
练习与应用
用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
练习与应用
【例】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组
质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是
。
②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
练习与应用
如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是
（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：
。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
练习与应用
基础知识提问
1.基因工程的概念？又名？原理？操作水平？优点？
2.重组DNA技术的基本工具？工具酶？
3.限制酶的来源？本质？ 作用？作用的化学键？结果？
4.DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？
各种类的不同（来源，作用）？
5.一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端，
断 个磷酸二酯键，需要 个水。
6.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：相同点？不同点（模板，作用过程）？
7.载体的本质？种类？作为载体需要的条件？
8.什么是质粒？
9.DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
科技探索之路
基因工程的诞生和发展
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因重组
②操作水平：
③操作结果：
①操作原理：
DNA分子水平
定向的改造生物遗传性状，获得人们所需的生物类型和生物产品
基因工程
人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础是？
（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。
（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。
（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。
（4）遗传信息的传递都遵循 。
DNA
中心法则
基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
基因工程
第3章 基因工程
重组DNA技术的基本工具
01
基因工程的基本操作程序
02
基因工程的应用
03
蛋白质工程的原理和应用
04
为了棉花姓“中国”
1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害以迅雷不及掩耳之势吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；
国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。
1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种——中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；
2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种——中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性;
2017年10月13日,农业部种子管理局副局长吴晓玲在回答媒体提问时表示, 目前中国自主选育的转基因棉花品种市场份额占到95%以上, 国外品种不到5%。
从社会中来
苏云金芽孢杆菌
提取
抗虫基因
普通棉花(无抗虫特性)
棉花细胞(含抗虫基因)
与运载体DNA拼接，导入
棉花植株(有抗虫特性)
表达 抗虫基因
（BT毒蛋白基因）
如何获得抗虫棉？需要什么工具？
3.1 重组DNA技术的基本工具
（三）分子运输车---载体
（一）分子手术刀---限制性内切核酸酶
（二）分子缝合针---DNA连接酶
“手术刀”
“缝合针”
“运输车”
1.来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来
2.功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
3.作用部位：磷酸二酯键，限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
4.切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端
限制性内切核酸酶
一
磷酸二酯键
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA
微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期的演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
限制性内切核酸酶
一
思考讨论1：仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制性内切核酸酶
一
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
限制性内切核酸酶
一
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
G
G
C T T A A
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
DNA连接酶——“分子缝合针”
2.分类：
二
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
1.作用:
类型 来源 功能 相同点 差别
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
与DNA聚合酶的比较：
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
1.作用: ① ．
② ．
2.作为运载体需具备的条件:
3.种类
将目的基因转移到受体细胞中去
利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
②有1个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
③具有标记基因，便于进行筛选
④对受体细胞无害
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
DNA分子复制的起点
有一个或多个限制酶酶切位点
有标记基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
①抗生素的抗性基因
②荧光蛋白基因
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
噬菌体或动植物病毒作为运载体的原理是：
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位： 磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
2.实验原理：
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
1.实验设计思路：
四
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
3.方法步骤
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
3.选材：
注意：
4.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
5.方法步骤
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
析出DNA
DNA的鉴定
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
方法步骤 （视频）
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
注意事项
1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
3．加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
4．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
5．预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
刑侦破案
拓展：DNA提取的应用
基因组测序
插入人胰岛素基因的大肠杆菌
基因工程
亲子鉴定
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
结果分析与评价
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
练习与应用
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
提示：迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
练习与应用
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
练习与应用
用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
练习与应用
【例】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组
质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是
。
②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
练习与应用
如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是
（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：
。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
练习与应用
基础知识提问
1.基因工程的概念？又名？原理？操作水平？优点？
2.重组DNA技术的基本工具？工具酶？
3.限制酶的来源？本质？ 作用？作用的化学键？结果？
4.DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？
各种类的不同（来源，作用）？
5.一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端，
断 个磷酸二酯键，需要 个水。
6.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：相同点？不同点（模板，作用过程）？
7.载体的本质？种类？作为载体需要的条件？
8.什么是质粒？
9.DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤