【同步学案】1.2微生物的培养技术及应用(课件版共78张PPT)
文档属性
| 名称 | 【同步学案】1.2微生物的培养技术及应用(课件版共78张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 1.2MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-03-25 11:12:03 | ||
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文档简介
(共78张PPT)
1.2 微生物的培养技术及应用
2019版新教材高中生物
选择性必修3精品学案
目 标 素 养
1.知道培养基的作用、分类及营养成分构成,培养科学思维能力。
2.能够区分消毒和灭菌,并针对不同物品选择不同的灭菌方法,培养分析、归纳能力。
3.知道培养基的制备流程,掌握倒平板和平板划线法的操作过程,培养科学探究能力。
目 标 素 养
4.通过对选择培养基原理的理解,形成生物与环境相适应的生命观念。
5.尝试通过稀释涂布平板法进行土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
知 识 概 览
一、微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
(1)培养基的概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(2)培养基的作用:用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
(3)培养基的种类:液体培养基和固体培养基(含凝固剂,如
琼脂)。
(4)培养基的营养构成:
①一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
②此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。如在培养乳酸杆菌时,需要在培养基中添加维生素;在培养霉菌时,一般需要将培养基调至酸性;在培养细菌时,需要将培养基调至中性或弱碱性;在培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件。
2.无菌技术
(1)目的:获得纯净的微生物培养物。关键是防止杂菌污染,主要包括消毒和灭菌。
(2)消毒:
①概念:是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
②方法:常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等。
(3)灭菌:
①概念:是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。
②方法:常用的灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。
(4)消毒和灭菌的主要操作:
①对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行
灭菌。
(5)做好消毒和灭菌工作后的注意事项:
①避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
②接下来的许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
3.微生物的纯培养
(1)相关概念:
①培养物:在微生物学中,将接种于培养基内,在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
②纯培养物:由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
③纯培养:获得纯培养物的过程称为纯培养。
(2)主要步骤:包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
(3)菌落:分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(4)采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上,之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(5)倒平板的流程:
拔出锥形瓶的棉塞→将瓶口迅速通过火焰→用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基(10~20 mL)倒入培养皿,立即盖上皿盖→等待培养基冷却凝固后,将培养皿倒过来放置。
微思考1所有微生物是否都可以用培养基进行培养 请说明理由。
提示:否。病毒是没有细胞结构的微生物,必须在活细胞内寄生并以复制的方式增殖,因此不能用培养基进行培养。目前常用于培养动物病毒的是活鸡胚。
微判断1
1.液体培养基含有水,而固体培养基不含水。( )
2.在培养酵母菌的过程中,为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速蘸取菌液。( )
3.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。( )
×
×
×
微训练连线。
二、微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
(1)筛选微生物的原理:人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基:
①概念:在微生物学中,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
②实例:利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基,从土壤中分离出分解尿素的细菌。此细菌能合成脲酶,脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。
2.微生物的选择培养
(1)目的菌:土壤中能分解尿素的细菌。
(2)方法:稀释涂布平板法。
(3)操作步骤:
将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀
↓
取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释至1×107倍
↓
取0.1 mL菌液,滴加到培养基表面
↓
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
↓
将涂布器放在火焰上灼烧,待酒精燃尽、涂布器冷却后,再进行涂布
↓
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀
↓
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30~37 ℃的恒温培养箱中培养1~2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
3.微生物的数量测定
(1)稀释涂布平板法:
①作用:除可以用于分离微生物外,也常用来统计样品中
活菌的数目。
②原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。
③方法:通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
④原则:为了保证结果准确,一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值。
⑤结果:统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(2)显微镜直接计数法:
①分类:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数。
②结果:一般是活菌数和死菌数的总和。
微点拨如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落,原因可能是稀释度不够,聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。
微思考21.如何鉴定分离得到的分解尿素的细菌
提示:细菌合成的脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3会使培养基的碱性增强,pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后,如果pH升高,指示剂将变红,说明该种细菌能够分解尿素。
2.下图是采用微生物纯培养的两种接种方法接种后培养的效果图。请思考获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么。
提示:获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得图B效果的接种方法为平板划线法。
微判断2统计菌落数目时为保证结果准确,一般选择菌落数目最多的平板进行统计。( )
×
三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.土壤取样
(1)土壤要求:酸碱度接近中性的潮湿土壤。
(2)取样环境:在城市,从公园里、街道旁、花盆中的土壤中取样;在农村,从农田或菜园里的土壤中取样。
(3)取样部位:距地表3~8 cm的土壤层。
2.样品的稀释
(1)测定土壤中细菌的数量,一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(2)选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证能从中选择出菌落数为30~300的平板进行计数。
3.微生物的培养与观察
(1)培养:根据不同微生物的需要,控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37 ℃的温度下培养1~2 d。
(2)观察:
①观察方法:每隔24 h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
②记录菌落的特征,包括菌落的形状、大小和颜色等。
一 培养基
重难归纳
1.培养基的营养构成
营养物质 定义 作用 主要来源
氮源 能提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机氮源:N2、NH3、铵盐、 硝酸盐等。有机氮源:尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水 — 不仅是优良的溶剂,还可维持生物大分子结构的稳定 —
营养物质 定义 作用 主要来源
无 机 盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
生长 因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分;参与代谢过程中的酶促反应 维生素、氨基酸、碱基
特别提醒 (1)对部分微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳源,又是氮源;有机碳源能提供能量,无机碳源不能提供能量。
(2)自养微生物的培养基中可不添加有机碳源,因其可利用CO2等无机碳源;异养微生物的培养基中必须添加有机碳源。固氮菌能利用空气中的N2,培养基中不需要加入氮源;非固氮菌不能利用空气中的N2,培养基中需加入氮源。
2.配制培养基的原则
(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等):选择或培养一般的微生物,可选择普通培养基,如牛肉膏蛋白胨培养基;如果选择或培养一些具有特殊代谢特性的微生物,则需要根据其代谢特性灵活变换培养基中的成分,如选择能分解石油的微生物,要加入石油作为唯一碳源。
(2)营养要协调:各种营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜:为维持pH的相对恒定,可在培养基中加入缓冲剂。不同微生物适宜生长的pH范围不同。
3.倒平板操作的注意事项
(1)培养基要冷却至50 ℃左右时开始倒平板。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过火焰。通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时,要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,不要完全打开,以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后,要将平板倒置。因为平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,既可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染,又可防止培养基表面的水分过度挥发。
(5)在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板就不能用来培养微生物了。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(6)整个操作过程要在酒精灯火焰附近进行,以避免杂菌污染。
在实验室中培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢产物,必须按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的培养基。
(1)培养基的营养构成是怎样的
提示:培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质。
(2)培养基灭菌后,为什么需要冷却至50 ℃左右时才能用来倒平板
提示:倒平板时,若高于50 ℃会烫手;低于50 ℃,若不及时操作,琼脂就会凝固。
典例剖析
下列有关微生物培养所需营养物质的叙述,正确的是( )
A.碳源不可能同时是氮源
B.所有的碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐
D.有些无机氮源也能提供能量
答案:D
解析:有些物质可以既作碳源又作氮源,如牛肉膏,A项错误。无机碳源(如CO2、NaHCO3等)不能提供能量,B项错误。有些无机物可作为碳源或氮源,如碳酸盐、硝酸盐,C项错误。有些无机氮源也可以提供能量,如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源,D项正确。
学以致用
不同的微生物对营养物质的需求不同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物的叙述,错误的是( )
A.氮源为该微生物提供必要的氮元素
B.碳源也是该微生物的能源物质
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
答案:B
解析:CO2是无机碳源,不能作为该微生物的能源物质。
二 无菌技术
重难归纳
1.几种消毒和灭菌方法的比较
2.无菌技术的常用方法
特别提醒 (1)消毒只能杀死一部分微生物,灭菌可以杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
(2)消毒和灭菌都是通过一定的理化手段,使微生物的蛋白质变性,失去生命活性。
(3)消毒与灭菌的原理是相同的,只是作用的条件不同,抑菌、灭菌的程度不同。
护士给病人注射药液前,要用酒精棉球擦拭注射部位,这属于消毒还是灭菌 无菌技术措施的选择有什么原则
提示:属于消毒。
无菌技术措施选择的原则如下。
①考虑效果:灭菌的效果比消毒要好。
②考虑操作对象的承受能力:活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法,而不能采用灭菌的方法。
③对于那些培养基中需要、但加热会分解的化合物,如尿素、NaHCO3,不能用高压蒸汽灭菌法灭菌,只能将其配成溶液,使用特定的器材单独过滤灭菌。
典例剖析
下列关于无菌技术的叙述,错误的是( )
A.对操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B.对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C.为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触
解析:对操作的空间、操作者的衣着和手进行的是消毒处理。
A
学以致用
无菌技术常围绕着如何避免杂菌污染展开。下列常见的无菌技术属于灭菌处理的是( )
A.用酒精擦拭双手
B.用紫外线照射实验室
C.对接种环进行灼烧处理
D.用氯气消毒水源
答案:C
三 微生物的纯培养与选择培养
重难归纳
1.平板划线法
(1)原理:通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
(2)主要步骤:接种环灭菌→取菌种→第一次平板划线操作→连续划线操作→培养。
(3)平板划线操作的注意事项:
①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌,划线操作结束时,仍需灼烧接种环,每次灼烧的目的如下表。
项目 第一次操作 第二次及之后每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线后的菌种数目减少 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
②灼烧接种环,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。
③第二次及之后的划线操作总是从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。
④划线时最后一区不要与第一区相连。
⑤划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
(4)平板划线示意图及培养后菌落分布示意图如下图所示。培养后一般可在最后一次的划线区找到单菌落,如下图中的“4”区。
2.稀释涂布平板法
(1)原理:将菌液进行一系列的梯度稀释,当样品的稀释度足够高时,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。
(2)主要操作环节:系列梯度稀释操作和涂布平板操作。
(3)接种工具:涂布器。
(4)稀释涂布平板操作的注意事项:
①酒精灯与培养皿的距离要适宜。
②移液管管头不要接触其他任何物体。
③移液管要在酒精灯火焰附近使用。
④将涂布器末端从酒精中取出时,要让多余的酒精在烧杯中滴尽,然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中,以免引燃酒精。
3.微生物的筛选
(1)选择培养基的设计思路:
①利用营养缺陷型选择培养基进行选择培养:通过控制培养基的营养成分,使营养缺陷型微生物不能正常生长。
②利用化学物质进行选择培养:在完全培养基中加入某些化学物质,利用加入的化学物质抑制某些微生物的生长,同时选择所需要的微生物。
③利用培养条件进行选择培养:改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等),筛选特定的微生物。
(2)实例:筛选分解尿素或纤维素的细菌。
若选择培养基的氮源只有尿素,只有能合成脲酶的细菌才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶的细菌由于不能分解尿素,缺乏氮源而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的细菌。
同理,若选择培养基中只有纤维素作碳源,只有能利用纤维素的细菌才能生存,其他微生物的生长则受到抑制。
特别提醒 (1)在培养基中加入酚红指示剂可以鉴别分解尿素的细菌。如果指示剂变红,说明该种细菌能分解尿素。
(2)在培养基中加入刚果红可以鉴别分解纤维素的细菌。如果培养基中出现以这些细菌为中心的透明圈,说明该种细菌能分解纤维素。
4.统计菌落数目的方法
方法 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
公式 每克样品中的菌数=(C÷V)×M C为某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V为涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M为稀释倍数 —
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分活菌和死菌
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
特别提醒 对照组的设置原则
(1)判断培养基中“是否有杂菌污染”,需将未接种的培养基同时进行培养。
(2)判断选择培养基“是否具有筛选作用”,需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行对比得出结论。
测定饮用水中细菌、病毒的含量是有效防控部分疾病的必要措施。某同学想利用所学知识调查本地饮用水质量是否合格,特别是大肠杆菌的数目是否超标,应该用平板划线法还是稀释涂布平板法 请说明理由。
提示:稀释涂布平板法。平板划线法只有最后一次划线的末端才会形成只由一个微生物形成的菌落,最开始划线的区域微生物很可能长成一片,导致无法计数。此外,灼烧接种环的时候也会杀死一部分微生物。稀释涂布平板法是按照一定浓度梯度稀释样品,当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
典例剖析
平板划线法和稀释涂布平板法是两种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A.平板划线法要求连续多划几次,且除了第一次划线外,每一次划线的起点都是上一次划线的终点
B.第一次划线需要将接种环灼烧灭菌,以后的划线可以不经灭菌直接划线
C.如果菌液本身浓度不高,则可以适当降低稀释倍数
D.充分稀释和连续划线的目的都是使形成的菌落由单一的活菌繁殖而成
B
学以致用
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍数为1×106的培养基中,得到以下几种统计结果,其中正确的是( )
A.涂布了1个平板,统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板,统计的菌落数分别是215和260,取平均值238
C.涂布了3个平板,统计的菌落数分别是21、212和256,取平均值163
D.涂布了3个平板,统计的菌落数分别是210、240和250,取平均值233
答案:D
解析:在设计实验时,每个稀释度一定要至少涂布3个平板作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性,所以A、B两项错误。C项虽涂布了3个平板,但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太大,说明操作过程可能有误,因此,不能简单地用3个平板的计数值求平均值,C项错误,D项正确。
1.在微生物的实验室培养中,下列操作过程不需要在无菌条件下进行的是( )
A.配制培养基 B.倒平板
C.接种 D.培养
答案:A
2.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理,这些处理依次用于杀死哪些部位的微生物 ( )
A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环
C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅
答案:C
解析:高压蒸汽灭菌通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是一种消毒的方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌,适用于微生物的接种工具,如接种环的灭菌。
3.在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中,下列关于倒平板的具体描述,正确的是( )
①待培养基冷却至40 ℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板 ②将灭过菌的培养皿放在桌面上,左手拔出棉塞 ③右手拿锥形瓶,使瓶口迅速通过火焰 ④用左手的拇指和食指完全打开皿盖 ⑤右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿,左手立即盖上培养皿的皿盖 ⑥等待平板冷却5~10 s,将平板倒过来放置,使皿盖在下,皿底在上
A.①③④⑤ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
C
解析:倒平板时,培养基高于50 ℃会烫手;低于50 ℃,若不及时操作,琼脂会凝固,故应待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板。无菌操作应贯穿操作的全过程,皿盖完全打开,空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(需5~10 min)后,将平板倒过来放置,使皿盖在下,皿底在上。
4.下列关于平板划线操作的叙述,正确的是( )
A.已灭菌的接种环和培养皿在操作过程中不再灭菌
B.从含有菌液的试管中取出菌液后,需马上塞上棉塞
C.打开培养皿盖,将蘸有菌液的接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线即可
D.最后将平板倒置,放入培养箱中培养
答案:D
解析:在平板划线操作中,已灭菌的接种环在每次划线后都必须用灼烧灭菌法再次灭菌,A项错误。盛有菌液的试管在打开后或重新塞棉塞前,都需将试管口通过火焰进行灼烧灭菌,B项错误。划线过程中,培养皿盖应打开一条缝隙,接种完毕后,迅速盖上皿盖,以防杂菌污染,C项错误。
5.稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
答案:C
解析:只有在稀释度足够高的菌液中,聚集在一起的微生物才会被分散成单细胞,从而在培养基表面形成单菌落,因此要将不同稀释度的菌液分别涂布到平板上培养。
6.下表是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基的配方。请回答下列问题。
(1)培养基的类型有很多,但培养基中一般都含有水、碳源、
和无机盐等营养物质。上述培养基配方中能充当碳源的成分是 。培养基配制完成后,一般还要调节pH,并对培养基进行 处理。该培养基从物理性质上分类属于 培养基。
试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 加水定容至
1 000 mL
用量/g 5 10 5 20 (2)最常使用的分离纯化微生物的两种接种方法是 法
和 法。
(3)假设培养结束后,发现培养基上的菌落连成一片,可能的原因是什么 (答出两点即可)。
答案:(1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 固体
(2)平板划线 稀释涂布平板
(3)稀释倍数不够,菌液的浓度太高;划线时,划完第一次没有灭菌即接着划第二次;培养过程中灭菌不严格,受到了其他微生物的污染(答出两点即可)
1.2 微生物的培养技术及应用
2019版新教材高中生物
选择性必修3精品学案
目 标 素 养
1.知道培养基的作用、分类及营养成分构成,培养科学思维能力。
2.能够区分消毒和灭菌,并针对不同物品选择不同的灭菌方法,培养分析、归纳能力。
3.知道培养基的制备流程,掌握倒平板和平板划线法的操作过程,培养科学探究能力。
目 标 素 养
4.通过对选择培养基原理的理解,形成生物与环境相适应的生命观念。
5.尝试通过稀释涂布平板法进行土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
知 识 概 览
一、微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
(1)培养基的概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(2)培养基的作用:用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
(3)培养基的种类:液体培养基和固体培养基(含凝固剂,如
琼脂)。
(4)培养基的营养构成:
①一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
②此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。如在培养乳酸杆菌时,需要在培养基中添加维生素;在培养霉菌时,一般需要将培养基调至酸性;在培养细菌时,需要将培养基调至中性或弱碱性;在培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件。
2.无菌技术
(1)目的:获得纯净的微生物培养物。关键是防止杂菌污染,主要包括消毒和灭菌。
(2)消毒:
①概念:是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
②方法:常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等。
(3)灭菌:
①概念:是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。
②方法:常用的灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。
(4)消毒和灭菌的主要操作:
①对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行
灭菌。
(5)做好消毒和灭菌工作后的注意事项:
①避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
②接下来的许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
3.微生物的纯培养
(1)相关概念:
①培养物:在微生物学中,将接种于培养基内,在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
②纯培养物:由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
③纯培养:获得纯培养物的过程称为纯培养。
(2)主要步骤:包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
(3)菌落:分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(4)采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上,之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(5)倒平板的流程:
拔出锥形瓶的棉塞→将瓶口迅速通过火焰→用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基(10~20 mL)倒入培养皿,立即盖上皿盖→等待培养基冷却凝固后,将培养皿倒过来放置。
微思考1所有微生物是否都可以用培养基进行培养 请说明理由。
提示:否。病毒是没有细胞结构的微生物,必须在活细胞内寄生并以复制的方式增殖,因此不能用培养基进行培养。目前常用于培养动物病毒的是活鸡胚。
微判断1
1.液体培养基含有水,而固体培养基不含水。( )
2.在培养酵母菌的过程中,为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速蘸取菌液。( )
3.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。( )
×
×
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微训练连线。
二、微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
(1)筛选微生物的原理:人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基:
①概念:在微生物学中,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
②实例:利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基,从土壤中分离出分解尿素的细菌。此细菌能合成脲酶,脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。
2.微生物的选择培养
(1)目的菌:土壤中能分解尿素的细菌。
(2)方法:稀释涂布平板法。
(3)操作步骤:
将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀
↓
取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释至1×107倍
↓
取0.1 mL菌液,滴加到培养基表面
↓
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
↓
将涂布器放在火焰上灼烧,待酒精燃尽、涂布器冷却后,再进行涂布
↓
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀
↓
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30~37 ℃的恒温培养箱中培养1~2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
3.微生物的数量测定
(1)稀释涂布平板法:
①作用:除可以用于分离微生物外,也常用来统计样品中
活菌的数目。
②原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。
③方法:通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
④原则:为了保证结果准确,一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值。
⑤结果:统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(2)显微镜直接计数法:
①分类:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数。
②结果:一般是活菌数和死菌数的总和。
微点拨如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落,原因可能是稀释度不够,聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。
微思考21.如何鉴定分离得到的分解尿素的细菌
提示:细菌合成的脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3会使培养基的碱性增强,pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后,如果pH升高,指示剂将变红,说明该种细菌能够分解尿素。
2.下图是采用微生物纯培养的两种接种方法接种后培养的效果图。请思考获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么。
提示:获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得图B效果的接种方法为平板划线法。
微判断2统计菌落数目时为保证结果准确,一般选择菌落数目最多的平板进行统计。( )
×
三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.土壤取样
(1)土壤要求:酸碱度接近中性的潮湿土壤。
(2)取样环境:在城市,从公园里、街道旁、花盆中的土壤中取样;在农村,从农田或菜园里的土壤中取样。
(3)取样部位:距地表3~8 cm的土壤层。
2.样品的稀释
(1)测定土壤中细菌的数量,一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(2)选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证能从中选择出菌落数为30~300的平板进行计数。
3.微生物的培养与观察
(1)培养:根据不同微生物的需要,控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37 ℃的温度下培养1~2 d。
(2)观察:
①观察方法:每隔24 h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
②记录菌落的特征,包括菌落的形状、大小和颜色等。
一 培养基
重难归纳
1.培养基的营养构成
营养物质 定义 作用 主要来源
氮源 能提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机氮源:N2、NH3、铵盐、 硝酸盐等。有机氮源:尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水 — 不仅是优良的溶剂,还可维持生物大分子结构的稳定 —
营养物质 定义 作用 主要来源
无 机 盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
生长 因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分;参与代谢过程中的酶促反应 维生素、氨基酸、碱基
特别提醒 (1)对部分微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳源,又是氮源;有机碳源能提供能量,无机碳源不能提供能量。
(2)自养微生物的培养基中可不添加有机碳源,因其可利用CO2等无机碳源;异养微生物的培养基中必须添加有机碳源。固氮菌能利用空气中的N2,培养基中不需要加入氮源;非固氮菌不能利用空气中的N2,培养基中需加入氮源。
2.配制培养基的原则
(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等):选择或培养一般的微生物,可选择普通培养基,如牛肉膏蛋白胨培养基;如果选择或培养一些具有特殊代谢特性的微生物,则需要根据其代谢特性灵活变换培养基中的成分,如选择能分解石油的微生物,要加入石油作为唯一碳源。
(2)营养要协调:各种营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜:为维持pH的相对恒定,可在培养基中加入缓冲剂。不同微生物适宜生长的pH范围不同。
3.倒平板操作的注意事项
(1)培养基要冷却至50 ℃左右时开始倒平板。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过火焰。通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时,要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,不要完全打开,以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后,要将平板倒置。因为平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,既可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染,又可防止培养基表面的水分过度挥发。
(5)在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板就不能用来培养微生物了。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(6)整个操作过程要在酒精灯火焰附近进行,以避免杂菌污染。
在实验室中培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢产物,必须按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的培养基。
(1)培养基的营养构成是怎样的
提示:培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质。
(2)培养基灭菌后,为什么需要冷却至50 ℃左右时才能用来倒平板
提示:倒平板时,若高于50 ℃会烫手;低于50 ℃,若不及时操作,琼脂就会凝固。
典例剖析
下列有关微生物培养所需营养物质的叙述,正确的是( )
A.碳源不可能同时是氮源
B.所有的碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐
D.有些无机氮源也能提供能量
答案:D
解析:有些物质可以既作碳源又作氮源,如牛肉膏,A项错误。无机碳源(如CO2、NaHCO3等)不能提供能量,B项错误。有些无机物可作为碳源或氮源,如碳酸盐、硝酸盐,C项错误。有些无机氮源也可以提供能量,如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源,D项正确。
学以致用
不同的微生物对营养物质的需求不同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物的叙述,错误的是( )
A.氮源为该微生物提供必要的氮元素
B.碳源也是该微生物的能源物质
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
答案:B
解析:CO2是无机碳源,不能作为该微生物的能源物质。
二 无菌技术
重难归纳
1.几种消毒和灭菌方法的比较
2.无菌技术的常用方法
特别提醒 (1)消毒只能杀死一部分微生物,灭菌可以杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
(2)消毒和灭菌都是通过一定的理化手段,使微生物的蛋白质变性,失去生命活性。
(3)消毒与灭菌的原理是相同的,只是作用的条件不同,抑菌、灭菌的程度不同。
护士给病人注射药液前,要用酒精棉球擦拭注射部位,这属于消毒还是灭菌 无菌技术措施的选择有什么原则
提示:属于消毒。
无菌技术措施选择的原则如下。
①考虑效果:灭菌的效果比消毒要好。
②考虑操作对象的承受能力:活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法,而不能采用灭菌的方法。
③对于那些培养基中需要、但加热会分解的化合物,如尿素、NaHCO3,不能用高压蒸汽灭菌法灭菌,只能将其配成溶液,使用特定的器材单独过滤灭菌。
典例剖析
下列关于无菌技术的叙述,错误的是( )
A.对操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B.对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C.为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触
解析:对操作的空间、操作者的衣着和手进行的是消毒处理。
A
学以致用
无菌技术常围绕着如何避免杂菌污染展开。下列常见的无菌技术属于灭菌处理的是( )
A.用酒精擦拭双手
B.用紫外线照射实验室
C.对接种环进行灼烧处理
D.用氯气消毒水源
答案:C
三 微生物的纯培养与选择培养
重难归纳
1.平板划线法
(1)原理:通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
(2)主要步骤:接种环灭菌→取菌种→第一次平板划线操作→连续划线操作→培养。
(3)平板划线操作的注意事项:
①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌,划线操作结束时,仍需灼烧接种环,每次灼烧的目的如下表。
项目 第一次操作 第二次及之后每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线后的菌种数目减少 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
②灼烧接种环,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。
③第二次及之后的划线操作总是从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。
④划线时最后一区不要与第一区相连。
⑤划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
(4)平板划线示意图及培养后菌落分布示意图如下图所示。培养后一般可在最后一次的划线区找到单菌落,如下图中的“4”区。
2.稀释涂布平板法
(1)原理:将菌液进行一系列的梯度稀释,当样品的稀释度足够高时,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。
(2)主要操作环节:系列梯度稀释操作和涂布平板操作。
(3)接种工具:涂布器。
(4)稀释涂布平板操作的注意事项:
①酒精灯与培养皿的距离要适宜。
②移液管管头不要接触其他任何物体。
③移液管要在酒精灯火焰附近使用。
④将涂布器末端从酒精中取出时,要让多余的酒精在烧杯中滴尽,然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中,以免引燃酒精。
3.微生物的筛选
(1)选择培养基的设计思路:
①利用营养缺陷型选择培养基进行选择培养:通过控制培养基的营养成分,使营养缺陷型微生物不能正常生长。
②利用化学物质进行选择培养:在完全培养基中加入某些化学物质,利用加入的化学物质抑制某些微生物的生长,同时选择所需要的微生物。
③利用培养条件进行选择培养:改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等),筛选特定的微生物。
(2)实例:筛选分解尿素或纤维素的细菌。
若选择培养基的氮源只有尿素,只有能合成脲酶的细菌才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶的细菌由于不能分解尿素,缺乏氮源而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的细菌。
同理,若选择培养基中只有纤维素作碳源,只有能利用纤维素的细菌才能生存,其他微生物的生长则受到抑制。
特别提醒 (1)在培养基中加入酚红指示剂可以鉴别分解尿素的细菌。如果指示剂变红,说明该种细菌能分解尿素。
(2)在培养基中加入刚果红可以鉴别分解纤维素的细菌。如果培养基中出现以这些细菌为中心的透明圈,说明该种细菌能分解纤维素。
4.统计菌落数目的方法
方法 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
公式 每克样品中的菌数=(C÷V)×M C为某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V为涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M为稀释倍数 —
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分活菌和死菌
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
特别提醒 对照组的设置原则
(1)判断培养基中“是否有杂菌污染”,需将未接种的培养基同时进行培养。
(2)判断选择培养基“是否具有筛选作用”,需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行对比得出结论。
测定饮用水中细菌、病毒的含量是有效防控部分疾病的必要措施。某同学想利用所学知识调查本地饮用水质量是否合格,特别是大肠杆菌的数目是否超标,应该用平板划线法还是稀释涂布平板法 请说明理由。
提示:稀释涂布平板法。平板划线法只有最后一次划线的末端才会形成只由一个微生物形成的菌落,最开始划线的区域微生物很可能长成一片,导致无法计数。此外,灼烧接种环的时候也会杀死一部分微生物。稀释涂布平板法是按照一定浓度梯度稀释样品,当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
典例剖析
平板划线法和稀释涂布平板法是两种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A.平板划线法要求连续多划几次,且除了第一次划线外,每一次划线的起点都是上一次划线的终点
B.第一次划线需要将接种环灼烧灭菌,以后的划线可以不经灭菌直接划线
C.如果菌液本身浓度不高,则可以适当降低稀释倍数
D.充分稀释和连续划线的目的都是使形成的菌落由单一的活菌繁殖而成
B
学以致用
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍数为1×106的培养基中,得到以下几种统计结果,其中正确的是( )
A.涂布了1个平板,统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板,统计的菌落数分别是215和260,取平均值238
C.涂布了3个平板,统计的菌落数分别是21、212和256,取平均值163
D.涂布了3个平板,统计的菌落数分别是210、240和250,取平均值233
答案:D
解析:在设计实验时,每个稀释度一定要至少涂布3个平板作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性,所以A、B两项错误。C项虽涂布了3个平板,但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太大,说明操作过程可能有误,因此,不能简单地用3个平板的计数值求平均值,C项错误,D项正确。
1.在微生物的实验室培养中,下列操作过程不需要在无菌条件下进行的是( )
A.配制培养基 B.倒平板
C.接种 D.培养
答案:A
2.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理,这些处理依次用于杀死哪些部位的微生物 ( )
A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环
C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅
答案:C
解析:高压蒸汽灭菌通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是一种消毒的方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌,适用于微生物的接种工具,如接种环的灭菌。
3.在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中,下列关于倒平板的具体描述,正确的是( )
①待培养基冷却至40 ℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板 ②将灭过菌的培养皿放在桌面上,左手拔出棉塞 ③右手拿锥形瓶,使瓶口迅速通过火焰 ④用左手的拇指和食指完全打开皿盖 ⑤右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿,左手立即盖上培养皿的皿盖 ⑥等待平板冷却5~10 s,将平板倒过来放置,使皿盖在下,皿底在上
A.①③④⑤ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
C
解析:倒平板时,培养基高于50 ℃会烫手;低于50 ℃,若不及时操作,琼脂会凝固,故应待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板。无菌操作应贯穿操作的全过程,皿盖完全打开,空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(需5~10 min)后,将平板倒过来放置,使皿盖在下,皿底在上。
4.下列关于平板划线操作的叙述,正确的是( )
A.已灭菌的接种环和培养皿在操作过程中不再灭菌
B.从含有菌液的试管中取出菌液后,需马上塞上棉塞
C.打开培养皿盖,将蘸有菌液的接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线即可
D.最后将平板倒置,放入培养箱中培养
答案:D
解析:在平板划线操作中,已灭菌的接种环在每次划线后都必须用灼烧灭菌法再次灭菌,A项错误。盛有菌液的试管在打开后或重新塞棉塞前,都需将试管口通过火焰进行灼烧灭菌,B项错误。划线过程中,培养皿盖应打开一条缝隙,接种完毕后,迅速盖上皿盖,以防杂菌污染,C项错误。
5.稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
答案:C
解析:只有在稀释度足够高的菌液中,聚集在一起的微生物才会被分散成单细胞,从而在培养基表面形成单菌落,因此要将不同稀释度的菌液分别涂布到平板上培养。
6.下表是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基的配方。请回答下列问题。
(1)培养基的类型有很多,但培养基中一般都含有水、碳源、
和无机盐等营养物质。上述培养基配方中能充当碳源的成分是 。培养基配制完成后,一般还要调节pH,并对培养基进行 处理。该培养基从物理性质上分类属于 培养基。
试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 加水定容至
1 000 mL
用量/g 5 10 5 20 (2)最常使用的分离纯化微生物的两种接种方法是 法
和 法。
(3)假设培养结束后,发现培养基上的菌落连成一片,可能的原因是什么 (答出两点即可)。
答案:(1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 固体
(2)平板划线 稀释涂布平板
(3)稀释倍数不够,菌液的浓度太高;划线时,划完第一次没有灭菌即接着划第二次;培养过程中灭菌不严格,受到了其他微生物的污染(答出两点即可)