2021-2022学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3 3.2.3DNA片段的扩增及电泳鉴定课件(共16张PPT)
文档属性
| 名称 | 2021-2022学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3 3.2.3DNA片段的扩增及电泳鉴定课件(共16张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 32.4MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-03-28 15:08:27 | ||
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文档简介
(共16张PPT)
3.2.3 基因工程的基本操作程序
实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
材料用具
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR方法步骤
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR实验操作过程
DNA片段的扩增及电泳鉴定
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
电泳方法步骤
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
电泳实验视频
DNA片段的扩增及电泳鉴定
新冠病毒核酸的PCR检测
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例2：通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（ ）
A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等
C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
典型例题
A
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例3：科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：
（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是________
_______________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______________。
（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是______________________
___________，PCR定点突变技术属于____________的范畴.
（3）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用__________________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是__________________________。
DNA双链复制
耐高温的
DNA聚合酶（或Taq酶）
引物
能生产出自然界不存在
蛋白质空间结构较为复杂，改造困难
蛋白质
引物
农杆菌转化法
植物细胞的全能性
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例4：实时荧光 RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在 PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA 聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用 RT-PCR 进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为 PCR扩增的模板，故需要将样本中的 RNA反转录为 DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原-抗体杂交
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）在PCR反应体系中，应包含一对特异性引物以及一个特异性荧光DNA探针。引物可根据__________________________________________来合成。探针带着淬灭基团可吸收荧光基团发出的光，此时是没有荧光的。根据图所示可知，DNA单链合成的过程中，________________________酶会“消化”掉探针,使荧光基团游离出来。每扩增一条DNA链，就有____________荧光分子产生。
（3）荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值），病毒核酸浓度越高，Ct值越____________。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。
新型冠状病毒的一段已知序列RNA片段
Taq（热稳定DNA聚合）
一个
越小
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.2.3 基因工程的基本操作程序
实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
材料用具
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR方法步骤
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR实验操作过程
DNA片段的扩增及电泳鉴定
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
电泳方法步骤
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
电泳实验视频
DNA片段的扩增及电泳鉴定
新冠病毒核酸的PCR检测
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例2：通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（ ）
A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等
C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
典型例题
A
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例3：科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：
（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是________
_______________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______________。
（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是______________________
___________，PCR定点突变技术属于____________的范畴.
（3）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用__________________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是__________________________。
DNA双链复制
耐高温的
DNA聚合酶（或Taq酶）
引物
能生产出自然界不存在
蛋白质空间结构较为复杂，改造困难
蛋白质
引物
农杆菌转化法
植物细胞的全能性
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
例4：实时荧光 RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在 PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA 聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用 RT-PCR 进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为 PCR扩增的模板，故需要将样本中的 RNA反转录为 DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原-抗体杂交
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）在PCR反应体系中，应包含一对特异性引物以及一个特异性荧光DNA探针。引物可根据__________________________________________来合成。探针带着淬灭基团可吸收荧光基团发出的光，此时是没有荧光的。根据图所示可知，DNA单链合成的过程中，________________________酶会“消化”掉探针,使荧光基团游离出来。每扩增一条DNA链，就有____________荧光分子产生。
（3）荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值），病毒核酸浓度越高，Ct值越____________。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。
新型冠状病毒的一段已知序列RNA片段
Taq（热稳定DNA聚合）
一个
越小
典型例题
DNA片段的扩增及电泳鉴定