高中生物人教版（2019）选择性必修3 3.1重组DNA技术的基本工具（共30张ppt）

(共30张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
1.重组DNA技术所需的三种工具
2.重组DNA技术所需的作用
3.基因工程载体需要具备的条件
基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
讨论：DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
非转基因番木瓜
转基因番木瓜
1.基因工程的三种工具
基因工程的概念：
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外____________和____________等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。
例如，通过转基因技术，可以实现利
用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，
目的基因是_______________，受体细胞是
________________，目的基因的表达产物是
____________。
DNA重组
转基因
DNA重组
人胰岛素基因
大肠杆菌细胞
人胰岛素
1.基因工程的概念
对基因工程概念的理解
基因工程的别名：
操作环境：
操作对象：
操作水平：
基本过程：
原 理：
结 果：
重组DNA技术、转基因技术
生物体外
基因
DNA 分子水平
剪切→拼接→导入→表达
基因重组
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
优 点：
2.基因工程的概念
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.生物界几乎共用一套遗传密码
2.基因工程的理论基础
1.来 源：
2.种 类：
主要来自原核生物
3.特 点：
数千种
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
碱基对
基本骨架
氢键
含氮碱基对
磷酸
磷酸二脂键
五碳糖
2.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
4.作用部位：
特定切点上的磷酸二酯键
5.识别序列长度：
6.结 果：
限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
产生黏性末端或平末端
2.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
黏性末端
平末端
（1） 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
2.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
（2） 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA（如噬菌体）的入侵。所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。这类原核生物之所以长期进化而不灭绝，限制酶可能有什么作用？
切割位点
2.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
思考：根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
2.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
T
A
T
A
EcoRI
EcoRI
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
1.作用：
3.DNA连接酶—“分子缝合针”
2.种类：
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
2.作用部位：
磷酸二酯键
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
3.DNA连接酶—“分子缝合针”
载体——质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
4.基因进入受体细胞的载体——分子运输车
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒也可以。
它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
4.基因进入受体细胞的载体——分子运输车
1.作用：
2.种类：
人类疱疹病毒
运载体需具备的条件：
4.基因进入受体细胞的载体——分子运输车
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
①能在受体细胞中稳定保存并复制
②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因
③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞
④对受体细胞无害、易分离
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
4.基因进入受体细胞的载体——分子运输车
1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
4.基因进入受体细胞的载体——分子运输车
质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是(　　)A．质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上B．质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器C．基因工程使用的质粒一定含有标记基因和复制原点D．质粒上碱基数量之间存在A＋G＝U＋C
C
4.基因进入受体细胞的载体——分子运输车
1.DNA粗提取的原理
5.DNA的粗提取与鉴定
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
1.DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
在 NaCl溶液中的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
提取原理
5.DNA的粗提取与鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
（1）对酶的耐受性∶蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
（2）对温度的耐受性∶大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
（3）对洗涤剂的耐受性∶洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
4.DNA 的鉴定
鉴定原理
1.DNA粗提取的原理
1）材料：新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
2）用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
5.DNA的粗提取与鉴定
2.目的要求：
3.材料用具：
研磨
①称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
过滤取上清液
②在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
4.过程：
5.DNA的粗提取与鉴定
析出DNA
③在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
4.过程：
5.DNA的粗提取与鉴定
DNA的鉴定
④取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
4.过程：
5.DNA的粗提取与鉴定
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl溶液 5mL 5mL
丝状物(DNA) 不加 加入
用玻璃棒搅拌 无 丝状物溶解
加入二苯胺试剂 4mL 4mL
沸水浴 5min 5min
观察现象 不变蓝 变蓝
空白对照组：
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
提示：迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。
细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。