高中生物人教版（2019）选择性必修3：3.1重组DNA技术的基本工具(课件共47张PPT)

(共47张PPT)
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋子生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程
技 术
目 的
研究水平
诱变育种是_______ (定向、不定向)的，
基因工程育种是_____(定向、不定向)的。
不定向
定向
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年发现，在细菌的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为载体，构建重组DNA，并在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成.
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋利用最新的基因组编辑技术对基因的定点插入、敲除或替换。
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭而导致产量大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，可抵御该病毒提高产量。
要将抗病毒的外源基因导入番木瓜的细胞中，需要哪些“分子工具”？
抗病毒基因
重组
DNA分子
“切割”
“拼接”
番木瓜体细胞
导入
表达
准确切割DNA分子的“分子手术刀”
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的
“分子运输车”
限制酶
DNA连接酶
载体
操作环境
原 理
生物体外
基因重组
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 生物界共用一套遗传密码
③ 遗传信息的传递都遵循中心法则
3.1
重
组
DNA
技
术
的
基
本
工
具
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
种类与命名：
数千种
一类酶
粘质沙雷氏杆菌
（Serratia marcesens）
大肠杆菌
（Escherichia coli R）
EcoRⅠ 限制酶
SmaⅠ 限制酶
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
作用部位：
特定切点上的磷酸二酯键
磷酸二酯键
5’
A
T
G
C
T
A
C
G
3’
5’
3’
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
作用特点：
5'
5'
3'
3'
EcoR Ⅰ
5'
5'
3'
3'
Sam Ⅰ
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
识别序列特点：
EcoRⅠ
5’……G-A-A-T-T-C……3’
3’……C-T-T-A-A-G……
SamⅠ
5’……C-C-C-G-G-G……3’
3’……G-G-G-C-C-C……5’
BamHⅠ
5’……G-G-A-T-C-C……3’
3’……C-C-T-A-G-G……5’
TaqⅠ
5’………T-C-G-A………3’
3’………A-G-C-T………5’
仔细观察左侧四种限制酶识别的特定序列有何特点？
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
读：5’→ 3’
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
EcoR Ⅰ
(在G与A之间切割)
中轴线
黏性末端
平末端
Sam Ⅰ
(在G与C之间切割)
产生黏性末端或平末端
切割结果：
g1
g2
g3
现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？
拓展思维
需要有几个酶切位点？
2
产生几个末端？共产生几个磷酸基团？
4
4
使用EcoRⅠ酶剪切
识别序列GAATTC
g1
g2
g3
CT TCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
5‘
5‘
3‘
3‘
能切下目的基因且不破坏目的基因
下图中，选择哪种限制酶来获得抗病基因（目的基因）？
拓展思维
选择限制酶切割目的基因的基本原则是：____________________________________________________。
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
T G A A T T C G
A C T T A A G C
A G A A T T C T
T C T T A A G A
拓展思维
DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
作用：
作用部位：
磷酸二脂键
不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是____________________________________________________。
DNA的基本组成单位、空间结构和碱基互补配对方式相同
DNA连接酶——“分子缝合针”
种类：
①E.coli DNA连接酶
②T4 DNA连接酶
从大肠杆菌中分离得到
只能连接互补黏性末端的DNA片段
从T4噬菌体中分离得到
黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
平末端
黏性末端
G
A
A
T
T
C
G
A
T
T
C
A
由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形成氢键，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能，所以T4 DNA连接酶黏性末端的连接速度比平末端的连接速度更快
3.作用部位:
磷酸二脂键
DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；
DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。
DNA连接酶
提示：DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 不同点 是否需要模板
接DNA链
作用过程
作用结果
用途
作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成
不需要
需要
双链
单链
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键
将已存在的DNA片段连接
合成新的DNA分子
基因工程
DNA复制
DNA连接酶——“分子缝合针”
总结归纳
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
碱基对之间
的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，
形成两条长链
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将DNA切成两个片段
几
种
相
关
酶
的
比
较
作用底物
作用部位
作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
DNA水解酶
DNA分子
磷酸二酯键
黏性末端或平末端
DNA分子片段
磷酸二酯键
重组DNA分子
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
新的DNA分子
DNA分子
氢键
单链DNA
DNA分子
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用：
将目的基因送入受体细胞
& 在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.最常用的载体——
质粒
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
质粒
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒
载体需具备的条件
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害、易分离
——便于重组DNA分子的筛选
★思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？
标记基因
如何利用标记基因的筛选呢？
普通培养基
不含抗生素
选择培养基50 g/ml四环素
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
【思考】：
噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是 。
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用
病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
种类 用途 不同点
质粒 噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入细菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别
种类：
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
手工制作： 重组DNA分子 P73
1）每组一张蓝纸条、一张粉纸条：抄DNA序列。
粉纸条两端用透明胶纸粘成环（充当质粒）
2）用剪刀将相关序列进行剪切
3）用透明胶将目的基因与载体相连接。
目的片段翻转过来，可以连接吗？目的片段可以自身环化吗？
获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,
目的是 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
但是使用该法缺点是容易发生
。
为了避免上述情况发生，可采取的措施是
。
用两种限制酶分别对目的基因和载体切割
用EcoRⅠ切下图含有“目的片段”的DNA分子，能成功不？
…ATCGAATCATCCCGGGCATTAGTGCCAAGTCTCTGGAATTCACGATTAG…
…TAGCTTAGTAGGGCCCGTAATCACGGTTCAGAGACCTTAAGTGCTAATC…
…ATCGAATCATCCCGGGCATTAGTGCCAAGTCTCTGGAATTCACGATTAG…
…TAGCTTAGTAGGGCCCGTAATCACGGTTCAGAGACCTTAAGTGCTAATC…
目的片段可以自身环化吗？
目的片段和载体的末端相同吗？
1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
随着生物技术的飞速发展，生产和销售“分子工具”的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有些这样的公司已成功上市，你还可以通过分析公司的股票价格走势，大致了解公司的经营状况以及投资者目前对该行业的认可程度。
在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
DNA的粗提取与鉴定
实验原理：
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/LNaCl溶液。
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
提取原理
鉴定原理
目的要求：
①了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
②学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
选材：
试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——破坏细胞，释放出细胞内的物质，溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
研磨液、二苯胺的配制方法-课本P117
DNA的粗提取与鉴定
材料用具：
2.过滤取上清液
3.DNA的析出
4.DNA的鉴定
1.研磨
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
二苯胺
2mol/L的NaCl
DNA的粗提取与鉴定
方法步骤：
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
对照组：如何设置？
阴性对照：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合.
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
思考与讨论：
如果是猪肝呢？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
结果分析与评价：
评价结果
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果；如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等；看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
结果分析与评价：
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
进一步探究：
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。