第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
课标内容要求 核心素养对接
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。2.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.生命观念——通过实例理解各类微生物都能适应其生活环境。2.科学思维——根据微生物的代谢类型配制选择培养基；总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。3.科学探究——讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验方法并对实验结果进行评价。
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1．接种
(1)定义：接种是指微生物进入培养基质的过程。
(2)类型：自然接种和人为接种。
2．单菌落
在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。
3．平板划线法
(1)连续平行划线是从培养基上的一点出发，向左右连续划平行线至覆盖整个培养基表面。(如图A)
(2)扇形划线是从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从同一起点变换方向划线。(如图B)
A．连续平行划线 B．扇形划线
(3)多次连续平行划线接种时，划线可分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。(如图C)
(1) (2) (3) (4)
C．多次连续平行划线
4．稀释涂布平板法
稀释涂布平板法(pour spread method)接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记后，将稀释度不同的菌液各取0.1 mL，加在固体培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养。
二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
1．测定微生物数量的目的：了解目标微生物的繁殖速度_。
2．稀释涂布平板法
(1)问题：平板上的菌落即使是分开的，也可能难以数清其数量。如果菌落太多，准确数出菌落数并不容易，这会导致最终的计算结果出现较大误差。而菌液稀释度过大，菌落数少，虽然容易准确计数菌落数，但可能存在较大的随机误差。
(2)解决方法：一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。即：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。
3．显微镜计数法
(1)血细胞计数板
①侧面观
1．血细胞计数板 2.盖玻片 3.中央平台 4.凹槽
②中央平台上、下两个部分各刻有一个计数区。
③计数区由长、宽各1 mm的9个大方格组成。
④大方格
a．每个大方格内的液体体积：0.1_mm3。
b．分类：红细胞计数区和白细胞计数区。
c．红细胞计数区又用双线分成25(或16)个中方格，每个中方格再用单线划分为16(或25)个小方格。
(2)用显微镜进行酵母细胞计数
①步骤：先将专用的盖玻片盖在计数板上，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加摇匀的酵母菌悬液，让菌液渗入盖玻片下直至充满计数区。
②注意事项：滴加菌液时，一方面要避免菌液滴到盖玻片上，另一方面要注意防止产生气泡，以免影响计数结果。
③计数区域：红细胞计数区。
④取样原则：随机取样。
⑤对有25个中方格的红细胞计数区取样方法：“五点取样”。
⑥在计数每一小方格中的细胞数时，应只计数每一小方格上方和左侧线条上的细胞数(即“数上不数下”“数左不数右”)。
⑦每毫升菌液中的酵母细胞数：酵母细胞个数/mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10_000×稀释倍数。
三、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1．不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。
2．许多微生物的代谢方式并不唯一。
(1)某些异养型微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质。
(2)自养型微生物也并非不能利用有机物生长。
(3)营养方式的可变性提高了微生物在环境中的生存能力。
3．培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。
4．选择培养基
(1)概念：在培养基中添加(或减去)某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
(2)用途
①从混杂的微生物群体中快速筛选出所需种类的目标微生物。
②从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出特定的细胞。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。 (√)
2．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。
(×)
提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。
3．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (×)
提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
4．借助于显微镜、血细胞计数板也能在显微镜下直接对菌液中的酵母细胞进行计数。 (√)
5．异养微生物只能以有机物为碳源，自养微生物也可以利用有机物生长。 (×)
提示：某些异养微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质，它们只是不以CO2为唯一碳源。
6．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。 (×)
提示：尿素分解菌将尿素转化为氨，使培养基的pH升高。
采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1．两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
2.接种、培养并分离酵母菌
(1)目的要求
①用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
②用液体培养基大量扩增酵母菌。
(2)方法步骤
制作平板→接种(用平板划线法接种、用稀释涂布平板法接种，将菌种接种到液体培养基中)→培养→观察培养结果→挑取菌落利用划线法接种至试管斜面培养基中。
(3)注意事项
①在用接种环蘸取菌液进行接种前，应在酒精灯火焰上从接种环的圆环处依次向上灼烧灭菌。
②为避免灭菌后接种环的高温烫死菌种，应在挑取菌种前将接种环贴在培养容器内壁上降温。
③初次划线时可参照培养皿底面的标记点进行划线，以保证有最好的划线分离效果。
④在使用蘸有酒精的涂布器对平板中的菌液进行涂布时，应先在火焰上使酒精燃烧尽。此时手持涂布器的部位应高于火焰上的部位，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。
⑤涂布和划线均应在酒精灯旁进行。
⑥用接种环在无菌条件下将菌液接种到液体培养基中，同时以不接种菌液的液体培养基作为对照。
1．在分离、纯化酵母菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示，且甲、乙的对应位置不变。有关叙述错误的是( )
甲 乙
A．配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌
B．甲中a区域为划线的起始位置
C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D．图示接种过程中接种环灼烧了5次
B [为了能彻底灭菌，配制的培养基需进行高压蒸汽灭菌，A正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，甲中d区域为划线的起始位置，a区域为划线的结束位置，B错误；连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落，C正确；由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，图示甲中共有4次划线接种，接种过程中接种环灼烧了5次，D正确。]
2．下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( )
A．采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌往往会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用菌落密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
C [稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，值得注意的是，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，A、B正确。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数；设计实验时，一定要至少用三个平板做重复实验，才能增强实验的说服力和准确性。分析结果时，一定要考虑所设置的重复实验的结果是否一致，差别不大时，取平均值作为统计结果，C错误，D正确。]
微生物的数量测定和选择培养
1．微生物的计数
常用的微生物的计数方法有直接计数法和间接计数法。二者比较如下：
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂，且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×10 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝×稀释倍数
2.特定培养基的设计原理与应用实例
特定培养基的设计原理 应用实例
具体处理 分离菌种
依据营养需求 不添加碳源 自养微生物(硝化细菌等)
不添加氮源 固氮微生物(圆褐固氮菌等)
以尿素为唯一氮源 能分解尿素的微生物
以石油为唯一碳源 能分解石油的微生物
加入某种化学物质，其不作为营养物质，对目标微生物无害，但会抑制或杀死其他微生物 加入青霉素、四环素或链霉素 抑制细菌和放线菌生长→分离酵母菌、霉菌等
加入10%的酚 抑制细菌和霉菌生长→分离放线菌
利用特殊环境 置于无氧条件下 厌氧型和兼性厌氧型微生物→分离乳酸菌、酵母菌等
置于高盐环境中 其他菌在高盐环境中易失水而不能生存→分离金黄色葡萄球菌
置于高温环境中 其他微生物因酶失活而无法生存→分离耐高温微生物
1．在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？
提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
2．稀释涂布平板法和显微镜计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微镜计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
3．(2021·四川绵阳期末)某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是( )
A．可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L
B．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C．一般选择菌落数为30～300的平板进行计数
D．显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数
D [将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，据此可得出每升样品中的活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×1 000×100＝5.7×107个/L，A正确；由于两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，C正确；显微镜计数法统计的是稀释液中所有菌体的数目，包括活菌和死菌，D错误。]
4．(2020·济南外国语学校高二月考)某种菌在30 ℃的环境下，经过6周后会产生2种不同的酶，几乎可将PET塑料完全分解。下图是分离、纯化和保存菌株的过程，相关叙述正确的是( )
A．塑料垃圾中含有大量微生物，是分离该菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入PET塑料粉末，通过菌落特征挑出分解PET塑料的菌落
C．通过涂布平板法可以获得单菌落
D．斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株
B [塑料垃圾中含有大量微生物，但不一定含有分解PET塑料的菌株，A项错误；筛选培养基中需要加入PET塑料粉末，通过菌落特征挑出分解PET塑料的菌落，从而获得分解PET塑料的菌株，B项正确；在涂布平板上长出的菌落，可以通过划线或稀释涂布平板法进一步纯化得到单个菌落，C项错误；斜面培养基中含有大量营养物质，可在低温下临时保存菌株，如果长期保存菌株应选择甘油管藏法，D项错误。]
能分解尿素的微生物的分离与计数
1．实验原理
(1)分离原理
当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶(urease)的微生物才能在该培养基中生长。因为它们可以通过脲酶将尿素降解为氨，作为其生长的氮源。利用这种培养基就分离出土壤中能产生脲酶的微生物。
(2)鉴定原理
因为微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂，就可根据菌落周围是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
2．目的要求
(1)利用选择培养基分离能产生脲酶的微生物。
(2)观察微生物代谢改变环境pH的现象。
(3)利用稀释涂布平板法对微生物进行计数。
3．方法步骤
制备培养基
↓
灭菌：在121 ℃下灭菌15 min后待用
↓
倒平板
↓
制备土壤细菌悬液：梯度稀释
5．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是( )
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的LB培养基作为对照
C．该实验应采用稀释涂布平板法
D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B [利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的LB培养基上培养作为对照，B错误；该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]
6．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。
(1)若取土样6 g，应加入________mL的无菌水配制成稀释10的倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为_______________。将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中________倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为________个。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目________(填“低”或“高”)。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数/个 1号平板 478 367 277 26 5
2号平板 496 354 261 20 8
3号平板 509 332 254 29 3
(2)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_______________________________
________________________________________________________________。
将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为________个/mL。
[解析] (1)根据题意分析，需要稀释10倍的土壤溶液，因此应该将6 g土样加入54 mL的无菌水进行配制；将103～107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入固体培养基上，用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上；估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30到300之间的平板，分析表格中数据可知，稀释倍数为105的平板菌落数在这一范围；每克土壤中的菌落数为(277＋261＋254)÷3×105÷0.2÷6＝2.2×107个。稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于菌落之间会相互重叠，因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。(2)用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度＝45×5÷0.1÷10－3×102＝2.25×108个/mL。
[答案] (1)54 稀释涂布平板法 105 2.2×107 低 (2)将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落 2.25×108
微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。如图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。
通过本案例培养学生的演绎与推理和对实验结果的交流与讨论能力。
(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是什么？(科学思维)
提示：将微生物分散成单个细胞，进而获得单个菌落。
(2)根据D的染色结果，判断B平板中产油脂芽孢杆菌的菌落是哪一个？(科学思维)
提示：3。
(3)采用什么方法将B平板中的产油脂芽孢杆菌的单菌落进一步纯化培养得到E？(科学思维)
提示：平板划线法或稀释涂布平板法。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。2.平板划线法接种时，通常用接种环蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后，在固体培养基表面进行连续平行划线、扇形划线或其他形式的划线，以实现接种的目的。3.稀释涂布平板法接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记后，将稀释度不同的菌液各取0.1 mL，加在固体培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养。4.利用稀释涂布平板法计数微生物数量：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。5.利用显微镜进行酵母细胞计数：每毫升菌液中的酵母细胞数＝80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释倍数。6.在培养基中添加(或减去)某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
A [在A项的培养基中既有尿素作为唯一氮源，又有其他各种成分，可以选择出分解尿素的细菌，而B项中无尿素作氮源，C项中缺少碳源，D项中有牛肉膏可提供氮源。]
2．(2020·山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是( )
A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B．统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
C．筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
A [统计样品中的活菌数目时一般用稀释涂布平板法，B错误；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，培养基中还应含有水、无机盐、碳源等营养物质，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。]
3．(2020·太原实验中学高二月考)判断选择培养基是否起到了选择作用时，需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．接种了的LB培养基
C．未接种的LB培养基
D．接种了的选择培养基
B [选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组，需要用接种了的LB培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
4．(2020·陕西延安吴起高中高二期末)下图表示培养和分离酵母菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是( )
① ② ③
A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
C．步骤②应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤③划线结束后在培养皿盖上做好标注
C [图中①是倒平板，②是进行平板划线，③是培养。对实验操作的空间、操作者的衣着和手需要进行消毒处理，A项错误；倒完平板后立即盖上培养皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B项错误；步骤②应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落，C项正确；图中操作结束后需在培养皿底标注菌种及接种日期等信息，而不是在培养皿盖上做标注，D项错误。]
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是__________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是_______________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
[解析] (1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的(含培养基的)培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
[答案] (1)脲酶 (2)无机盐 只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 (3)形状、大小 4.2×108 稀释涂布平板法 (4)单独设置一个灭菌后不接种样液的(含培养基的)培养皿进行培养
13/16课后素养落实(二) 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
(建议用时：40分钟)
题组一 采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1．下列关于平板划线操作的叙述，错误的是( )
A．每次划线前都要灼烧接种环
B．灼烧接种环后，要立即用接种环接种，防止杂菌污染接种环
C．要在酒精灯火焰旁进行
D．接种前，要将菌种试管口通过火焰
B [灼烧接种环后，将接种环伸入管内，让环端先接触培养基上未长菌的部位，使其冷却，然后轻轻挑取少量菌体，再进行接种。灼烧接种环后，不可立即用接种环接种，以免接种环温度过高，将菌种杀死。]
2．(2020·山东德州高二期末)某同学成功分离出了土壤中的固氮菌，结果如图所示。该实验使用了( )
A．平板划线法
B．液体培养基
C．不含氮源的培养基
D．不含碳源的培养基
C [图示结果呈现的是单个菌落，故该实验采用了稀释涂布平板法，A项错误；在固体培养基上才能形成菌落，B项错误；要分离土壤中的固氮菌，应该用不含氮源的选择培养基，C项正确；固氮菌为异养型生物，因此所用培养基需要加入碳源，D项错误。]
3．下列有关倒平板操作的叙述，错误的是( )
A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上
D．等待培养基冷却凝固后需要倒过来放置
C [整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵，因此灭过菌的培养皿应放在火焰旁，打开的锥形瓶瓶口应迅速通过火焰，培养皿应打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不能将培养皿盖完全打开，等待培养基冷却凝固后需要倒过来放置。]
4．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用
B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
B [对未接种的培养基进行培养，起到对照作用，可用来确定培养基是否被杂菌污染。]
5．下图是某同学分离和培养土壤中微生物的部分操作步骤和实验结果示意图。回答下列问题：
A B C
D E F
(1)利用固体培养基培养土壤中的微生物时，除考虑各种营养条件外，还需要控制的培养条件有____________________(至少写两点)等。接种前应该先检测固体培养基是否被污染，检测的具体方法是_______________________________
____________________________________________________________________。
(2)图示中用平板划线法接种的操作顺序是A→B→______________；以上操作步骤中存在明显错误的是__________(用字母表示)，该操作的正确方法是__________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
[解析] (1)若用该培养基培养土壤中的微生物，除考虑各种营养条件外，还要考虑温度、pH、氧气、无菌和渗透压等条件。检测固体培养基是否被污染的方法是将未接种的培养基在适宜的环境中放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。(2)图示是平板划线法接种操作示意图，其操作顺序是A→B→E→D→C→F；为了防止杂菌污染，接种应该在酒精灯的火焰旁进行，因此以上操作中存在错误的步骤是C。
[答案] (1)温度、pH、氧气、无菌(至少写两点) 将未接种的培养基在适宜的环境中放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生 (2)E→D→C→F C 在酒精灯的火焰旁划线
题组二 微生物的数量测定与选择培养
6．(2020·河北省张家口一中期中)下列有关土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是( )
A．实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
B．分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基
C．测定土壤样品中的活菌数目，常用显微镜计数法
D．接种土壤微生物稀释液时，平板划线法通过连续划线的操作使微生物均匀分布
B [在分离土壤中的尿素分解菌实验中，采集的土样经高温灭菌后，土样中的微生物被杀死，再制取土壤稀释液接种并培养，不会得到菌落，A错误；分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基，只有能利用尿素的细菌才能生长繁殖，B正确；测定土壤样品中的活菌数目，常用稀释涂布平板法，显微镜计数法是将活菌和死菌一同计数，C错误；接种土壤微生物稀释液时，稀释涂布平板法的操作使微生物均匀分布，D错误。]
7．(2020·山东青州一中高二期末)下列有关土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，错误的是( )
A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C．培养基应以尿素为唯一氮源并加入酚红作为指示剂
D．应选择菌落数在300以上的平板进行计数，并求其平均值
D [将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确；同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，减少实验误差，B正确；培养基应以尿素为唯一氮源并加入酚红作为指示剂，分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨，使培养基呈红色，C正确；统计尿素分解菌的数目时，以菌落数为30～300的平板进行计数，求其平均值，D错误。]
8．下列关于分离微生物和统计菌落数目方法的叙述，不正确的是( )
A．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
B．在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多，否则会导致菌体堆积，影响分离效果
C．采用稀释涂布平板法计数获得的菌落数往往少于实际的活菌数
D．若在稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL下涂布5个细菌培养基平板，细菌菌落数分别为13、153、462、175和191，则每克土壤样品中的细菌数量为1.73×107个/mL
D [当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，因此菌落数可以代表最初菌体的数目，A正确；在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多，通常为0.1 mL，否则会导致菌体堆积，影响分离效果，B正确；采用稀释涂布平板法计数获得的菌落有可能是由多个细菌形成的，所以往往少于实际的活菌数，C正确；为了保证结果准确，一般选取菌落数为30～300的平板进行计数，故题中细菌菌落数分别为153、175、191的三个平板符合计数要求，所以每克土壤样品中的细菌数量＝(153＋175＋191)÷3÷0.1×105＝1.73×108个/mL，D错误。]
9．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是( )
A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
C [为了筛选、获取能利用多环芳烃为碳源的菌种，首先是取材，应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用，A项正确；其次配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基，B项正确；然后进行接种，在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，在适宜的条件下进行培养，若将土壤稀释液进行灭菌，就不能筛选出能高效降解原油的菌株，C项错误；在选择培养基上形成的菌落，若该菌落周围有分解圈，即为所需菌种，D项正确。]
10．反刍动物的瘤胃中有许多能分解尿素的微生物。为了研究利用尿素配制的反刍动物饲料，以替代部分蛋白质饲料，降低饲料成本，进行了相关实验。请回答下列问题：
(1)尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时________。
A．葡萄糖在培养基中含量越多越好
B．尿素在培养基中含量越少越好
C．尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的氮源为尿素
D．尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮
(2)瘤胃中的尿素分解菌能将尿素分解成________，其中的________可用于合成微生物蛋白，该蛋白质是反刍动物的优质氮源。
(3)为研究瘤胃中尿素分解菌的种类，实验者配制以尿素为唯一氮源的培养基，该培养基从功能上属于__________培养基。可在培养基中加入________指示剂以初步鉴定这些菌能够分解尿素，为确证这些菌是尿素分解菌，可通过酶活性测定及基因数据库比对，只有具有脲酶活性和________基因的菌，才是真正的尿素分解菌。
(4)研究发现，如果只饲喂尿素配制的饲料，会导致反刍动物氨中毒，请根据高中所学知识分析其原因是___________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)尿素既可以作为尿素分解菌的氮源，也可以作为其碳源，葡萄糖在培养基中并不是越多越好，A项错误；添加尿素的目的是筛选尿素分解菌，其他微生物不能很好地生活在该培养基上，尿素在培养基中不是越少越好，过少就失去选择作用，过多又会使细胞失水死亡，B项错误；尿素分解菌没有固氮能力，故培养基中需要添加尿素作为有机氮源，C项正确，D项错误。(2)尿素分解菌能将尿素分解成CO2和NH3，其中的NH3可用于合成微生物蛋白，为反刍动物提供优质氮源。(3)以尿素为唯一氮源的培养基，尿素分解菌可以生存，而其他微生物不能存活，因此该培养基从功能上属于选择培养基；可在培养基中加入酚红指示剂以初步鉴定这些菌能够分解尿素；为确证这些菌是尿素分解菌，可通过酶活性测定及基因数据库比对，只有具有脲酶活性和脲酶基因的菌，才是真正的尿素分解菌。(4)如果只饲喂尿素配制的饲料，会导致反刍动物氨中毒，原因是氨会使瘤胃液pH增大。
[答案] (1)C (2)CO2和NH3 NH3 (3)选择 酚红 脲酶 (4)氨会使瘤胃液pH增大
11．(2020·枣庄高二检测)筛选是分离和培养微生物新类型常用的手段，下列有关技术中不能筛选成功的是( )
A．在全营养的LB培养基(普通培养基)中，筛选大肠杆菌
B．在尿素固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物
C．用以纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物
D．在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体的微生物
A [在全营养的LB培养基中，几乎所有细菌都能生长，不能筛选出大肠杆菌，A符合题意；在尿素固体培养基中，只有能分解尿素的微生物才能生长，不能分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长，能够筛选分解尿素的微生物，B不符合题意；在纤维素为唯一碳源的培养基上，只有能分解纤维素的微生物才能生长，不能分解纤维素的微生物因缺乏碳源不能生长，能筛选分解纤维素的微生物，C不符合题意；在培养基中加入不同浓度的氯化钠，能筛选抗盐突变体微生物，D不符合题意。]
12．下列有关多次连续平行划线接种时的叙述，错误的是( )
A．第一次操作前灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D．划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者
C [平板划线法通过接种环在固体培养基表面进行连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，以形成单菌落。因此，每次划线时，都应将接种环上原有的菌体杀死，划线时分散的菌体来自上次划线结束时的菌体。]
13．尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。下列有关土壤中尿素分解菌的分离和培养的叙述，正确的是( )
A．培养基中加入尿素作为唯一氮源，该培养基是鉴别培养基
B．测定土壤中分解尿素的细菌数量和测定土壤中放线菌的数量可采用相同的稀释度
C．细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高
D．利用稀释涂布平板法可以直接完成土壤中分解尿素的细菌的分离计数和纯化鉴定
C [培养基中加入尿素作为唯一氮源，该培养基是选择培养基，A错误；因为土壤中各类微生物的数量不同，故为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离，B错误；细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，可加入酚红指示剂进行检测，C正确；鉴定分解尿素的细菌应该用加酚红的鉴别培养基，D错误。]
14．下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，有关叙述错误的是( )
A．在配制步骤②③的培养基时，应先调pH再进行高压蒸汽灭菌
B．步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C．步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
C [配制培养基时，应先调pH再进行高压蒸汽灭菌，A项正确；步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，获得单细胞菌落，B项正确；步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，C项错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D项正确。]
15．(2020·广东佛山顺德区高二期中)为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行下图A所示的实验。
图A
图B
(1)配制好的培养基灭菌通常可以使用____________法。步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是________________________。这种培养基从功能上看属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基。
(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是________________；推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是________；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________________________
___________________________________________________________________。
(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为________个。这种计数方法得到的结果一般比实际值偏小，原因可能有________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)步骤⑤需要振荡培养，其目的是提高培养液溶氧量，同时使__________________________________________________________________，
提高营养物质利用率。
(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是______________________________
________________________________________________________________。
[解析] (1)根据题意，要分离和纯化高效分解石油的细菌，配制好的培养基灭菌通常可以使用高压蒸汽灭菌法。图中步骤②是扩大培养来自被石油污染过的土壤中的细菌，步骤③是利用石油扩大培养分解石油的细菌，步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是步骤③的培养基中石油是唯一碳源。这种培养基从功能上看属于选择培养基。(2)步骤④是对分解石油的细菌进行分离，分析图B可知，分解石油的细菌在培养基上所形成的是单个菌落，说明同学甲进行过程④的操作中接种方法是稀释涂布平板法；图B中培养基表面左侧的菌落数目明显比右侧多，推测同学甲用此方法接种时可能涂布不均匀；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作，据题干信息计算，可得出每升样品中的活菌数为(56＋58＋57)÷3÷0.1×100×1 000＝5.7×107(个)。由于细菌会相互重叠，当两个或多个细菌连在一起时，形成菌落后，平板上观察到的只是一个菌落，所以导致统计的细菌数目往往比实际数目少。(4)步骤⑤需要振荡培养，其目的是提高培养液溶氧量，同时使菌体与培养液充分接触，提高营养物质利用率。(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出分解石油能力最好的细菌，其中石油剩余量最少的一组所含的细菌就是分解石油能力最好的细菌。
[答案] (1)高压蒸汽灭菌 步骤③的培养基中石油是唯一碳源 选择 (2)稀释涂布平板法 涂布不均匀 检测培养基平板灭菌是否合格 (3)5.7×107 当两个或多个细菌连在一起时，形成菌落后，平板上观察到的只是一个菌落 (4)菌体和培养液充分接触 (5)筛选出分解石油能力最好的细菌
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