第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性
第1课时 重组DNA技术的基本工具
课标内容要求 核心素养对接
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 1.生命观念——运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。2.社会责任——关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来
1．概念：基因工程是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。
2．优点：通过在分子水平上对基因进行直接操控，打破常规育种难以突破的物种间的界限。
3．基因工程的核心：构建重组的DNA分子，因此早期也将基因工程称为重组DNA(recombinant DNA)技术。
4．基因工程诞生的基础
(1)20世纪，一批分子生物学家经过不懈地努力证明了DNA是遗传物质，确立并逐步完善了“中心法则”，阐明了遗传信息的传递和表达的机制。
(2)遗传密码的破译，为基因在不同种生物细胞内进行表达的设想奠定了理论基础。
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
1．限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
(1)来源：主要存在于细菌等微生物中。
(2)功能：能够识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，使得DNA双链在特定的位置断开。
(3)断开后的DNA末端
①黏性末端：末端有凸出的单链部分。
②平末端：末端没有单链部分。
(4)应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
2．DNA连接酶
(1)作用：将不同来源的2个DNA分子的双链通过磷酸二酯键分别连接起来，形成一个稳定的重组DNA分子。
(2)种类
种类比较 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只能连接黏性末端 既可以连接黏性末端，又可以连接平末端
3.载体
(1)概念：具备自主复制能力的DNA分子称为载体。
(2)作用：能与外源DNA相连接并将其送入受体细胞中进行扩增。
(3)理想的载体应具有以下3个特征：①含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在；②含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源基因插入载体中；③具有筛选作用的标记基因，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞。
(4)质粒
①本质：独立于细菌拟核DNA之外的较小的环状DNA分子。
②受体细胞：大多数质粒的受体细胞是细菌。
③适于作常用载体的特点：质粒在细菌内可以独立自主复制，具有多种限制酶识别序列，其携带的基因也会控制细菌的某些性状。
(5)种类：质粒，有些动、植物病毒及噬菌体。
三、DNA的粗提取和鉴定
1．实验原理
(1)提取思路
从目标生物中提取分离DNA，是进行基因工程操作的基础。利用DNA与其他物质成分在物理、化学性质上的差异，通过一定的方法，去除其他成分，提取DNA。
(2)提取原理
①细胞核内的DNA与蛋白质结合成染色体，提取核DNA先要破坏细胞，幼嫩的植物材料如果经过冷冻后再研磨，细胞结构容易被破坏；用十二烷基硫酸钠(SDS)处理材料，能使核蛋白变性并与DNA分离；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解。
②DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋与DNA形成钠盐；DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精，若在提取液中加入95%的冷酒精，能使DNA钠盐形成絮状沉淀物而析出。
(3)鉴定原理
在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
2．方法步骤
(1)研磨：称取10 g香蕉果肉，放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。
(2)过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将研磨液过滤入离心管中。
(3)离心：用天平称量装有液体的离心管的质量，将质量相近的离心管配对，放置于离心机相对位置。以3 000 r/min的转速离心2 min，取上清液倒入小烧杯中。
(4)加冷酒精：向小烧杯中倒入体积是上清液两倍的冷酒精，静置3～5 min，可见白色的絮状物出现。用玻璃棒缓缓搅动，絮状物会缠在玻璃棒上。
(5)鉴定：取两支试管，一支试管中加入提取出的絮状物，并加入2 mL二苯胺试剂；另一支只加入2 mL二苯胺试剂。用95 ℃水浴锅加热10 min，注意观察两支试管中溶液颜色的变化。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 (√)
2．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。 (×)
提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。
3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 (√)
4．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 (×)
提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。
5．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 (√)
6．在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。
(×)
提示：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．DNA连接酶
(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。
(2)连接方式：DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。
3．与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
4.质粒作为载体所具备的条件
条件 分析
稳定并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA的鉴定和选择
无毒害作用 避免受体细胞受到损伤
5.标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示：
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动、植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
1．(2020·河北沧州一中高二月考)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是( )
A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C．E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
B [DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。]
2．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
A [作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便于宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]
DNA的粗提取和鉴定
1．DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。
(3)实验过程中，搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
2．鉴定DNA
试管编号 A(对照组) B(实验组)
步骤1 2 mol/L的NaCl溶液5 mL 2 mol/L的NaCl溶液5 mL
步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物
步骤3 加4 mL二苯胺试剂，混匀 加4 mL二苯胺试剂，混匀
步骤4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的条件下遇二苯胺会被染成蓝色
3．以洋葱为材料进行DNA的粗提取与鉴定实验，相关叙述错误的是( )
A．可将洋葱换成哺乳动物的血液进行该实验
B．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质
C．向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时进行沸水浴，有利于显色反应的发生
A [哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体等，DNA含量少，不宜作为该实验的材料，A错误；在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，进而可去除不溶的杂质，B正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精，有利于获得较纯净的DNA，C正确；DNA与二苯胺试剂在沸水浴条件下反应呈蓝色，D正确。]
4．如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是( )
图1 图2
A．图1中的溶液a是NaCl溶液
B．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D．图2中试管1的作用是证明2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
C [图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A错误；加入冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，B错误；图2所示操作中的错误是试管中的液面高于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。]
掌握各步骤的原理和目的，是分析解答DNA的粗提取与鉴定类试题的关键。
步骤 原理或目的
充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中
过滤(或离心) 除去细胞膜等不溶杂质，得到与蛋白质等杂质结合在一起的溶解于滤液(或上清液)的DNA
搅拌(或离心)析出DNA 加入预冷的酒精溶液，蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，将DNA和蛋白质等杂质分离
溶解 用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA
鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在
某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500
本案例考查演绎与推理的科学思维。
(1)该DNA分子上有几个a酶识别和切割的位点？有几个b酶识别和切割的位点？(科学思维)
提示：该DNA分子上有3个a酶识别和切割的位点；有2个b酶识别和切割的位点。
(2)a酶和b酶切出的黏性末端能相互连接吗？(科学思维)
提示：a酶和b酶切出的黏性末端相同，因此能相连。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.基因工程的核心是构建重组的DNA分子，因此早期也将基因工程称为重组DNA技术。2.重组DNA技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。3.限制性内切核酸酶能够识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，使得DNA双链在特定的位置断开。4.E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既可以连接两个互补的黏性末端，也可以连接两个平末端。5.理想的载体应具有以下3个特征：（1）含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在；（2）含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源基因插入载体中；（3）具有筛选作用的标记基因，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞。6.在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1．(2020·黑龙江哈师大附中月考改编)下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是( )
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D．限制酶只能从原核生物中提取
B [一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。]
2．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶连接的是两个DNA片段碱基对之间的氢键
B．DNA连接酶连接的是DNA单链上的磷酸和脱氧核糖
C．DNA连接酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端
D．E.coil DNA连接酶能将双链DNA片段互补的平末端连接起来
B [DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，A错误；DNA连接酶连接的是DNA双链片段两个脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖，B正确、C错误；E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，D错误。]
3．质粒是基因工程最常用的载体。下列有关质粒的说法错误的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒中也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
A [质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。]
4．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精溶液可用来粗提取DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热
A [兔属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，A项错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白质后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此沿一个方向轻柔搅拌的目的是获得较完整的DNA分子，B项正确；在预冷的体积分数为95%的酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，C项正确；将析出的DNA溶解在物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才会呈现蓝色，D项正确。]
5．如表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题。
限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
(1)从表中4种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。
(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过________连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶________切割。
图1
图2
(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙____________(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：_____________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)由表中4种限制酶的切割位点可知，Sma Ⅰ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoR Ⅰ切割，切割后形成链状DNA。(4)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
[答案] (1)Sma Ⅰ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoR Ⅰ (4)能 二者具有相同的黏性末端
13/14课后素养落实(十三) 重组DNA技术的基本工具
(建议用时：40分钟)
题组一 基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来
1．(2020·山东济南外国语学校期中)下列叙述符合基因工程概念的是( )
A．在细胞内直接将目的基因与受体细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
B [基因工程是将外源基因导入生物体内进行DNA重组，赋予生物新的遗传特性，A不符合题意；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株属于诱变育种，C不符合题意；噬菌体自行感染细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴，D不符合题意。]
2．(2020·福建厦门一中月考)下列有关基因工程诞生的说法，错误的是( )
A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的
B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能
C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
D．基因工程必须在同物种间进行
D [基因工程又叫重组DNA技术，是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的，A正确；工具酶(限制酶和DNA连接酶)和载体的发现使基因工程的实施成为可能，B正确；尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码为基因的分离和合成提供了理论依据，与基因工程直接相关，C正确；1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，打破了物种间的障碍，实现物种间的基因交流，D错误。]
题组二 对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
3．(2020·福建厦门一中高二下月考)某DNA分子中含有某限制酶的一个识别序列，用该限制酶切割该DNA分子，可能形成的两个DNA片段是( )
序号 片段1 片段2
①
②
③
④
A．①② B．③④
C．①③ D．②④
B [限制酶识别序列的中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，若切割形成的是黏性末端，则黏性末端碱基应该互补配对。分析图中片段可知，③④中的片段可能由同一种限制酶切割所得，B正确。]
4．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
C [DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。]
5．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是CTTAAG和GAATTC。下图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
A B C D
A [用限制酶Mun Ⅰ 切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D项中质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。]
6．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
A B C D
C [A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。]
7．根据图表的内容回答问题。
几种限制酶识别序列切割位点
限制酶 Sma Ⅰ EcoRⅠ Pst Ⅰ
切割位点
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________________、________________________、________________________________________。
(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是________、________。
[解析] (1)含目的基因的DNA分子上含有2个EcoR Ⅰ和1个Pst Ⅰ的酶切位点，3个切点全部切开，则形成4种DNA片段。质粒与含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ酶切，目的基因两端和质粒切口处的黏性末端相同，只考虑两个DNA片段相连，则会形成3种连接产物，即质粒与质粒相连、质粒与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止任意连接，可选用EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶同时切割。
[答案] (1)4 质粒载体—质粒载体连接物 目的基因—目的基因连接物 质粒载体—目的基因连接物 (2)EcoRⅠ SmaⅠ
题组三 DNA的提取与鉴定
8．(2020·天津南开区测试改编)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)DNA粗提取结果如表。
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同________对DNA提取量的影响”。
(3)DNA的鉴定可用________试剂在________条件下进行。
(4)根据实验结果分析
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更________(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从________中提取的DNA量最多。
②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了________的活性，DNA降解速度减慢。
[解析] (2)根据表格可知，该实验的自变量是温度和不同材料，因此该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同(保存)温度对DNA提取量的影响”。(3)鉴定DNA时可用二苯胺试剂，在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。(4)①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色更深，说明DNA的提取量更多。结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多，因此其与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色最深。②出现结论1的原因是低温抑制了(核酸水解)酶的活性，DNA降解速度减慢。
[答案] (2)(保存)温度 (3)二苯胺 沸水浴 (4)①多 蒜黄 ②(核酸水解)酶
9．(2020·河南洛阳高二期中考试)限制酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为G↓GATCC和A↓GATCT。研究中用BamH Ⅰ切割DNA获得目的基因，用Bgl Ⅱ切割质粒，并用DNA连接酶连接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是( )
A．限制酶切割DNA过程中会将碱基对之间的氢键切断
B．含目的基因的DNA片段经BamH Ⅰ切割后形成的是平末端
C．经BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别
D．分别用BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ两种限制酶切割，能保证目的基因定向插入质粒
C [限制酶切断的是磷酸二酯键，A错误；含目的基因的DNA片段经BamH Ⅰ切割后形成的是黏性末端，B错误；两种限制酶切割产生的黏性末端互补，经过DNA连接酶处理后获得的重组序列是，该序列不能被BamHⅠ和Bgl Ⅱ识别，C正确；BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ两种限制酶切割产生的黏性末端互补，仍然会出现自身环化和反向连接现象，不能保证目的基因定向插入质粒，D错误。]
10．如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是( )
限制酶 BamH Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅱ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC
限制酶 Kpn Ⅰ Sau3A Ⅰ Sma Ⅰ
识别序列和切割位点 GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
注：Y表示C或T，R表示A或G。
A．一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B．限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部
C．不同限制酶切割后形成的黏性末端一定不同
D．限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
D [由于Y表示C或T，R表示A或G，说明一种限制性内切核酸酶能识别一种或多种特定的脱氧核苷酸序列，A错误；限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部，如Sau3A Ⅰ，B错误；不同限制酶切割后形成的黏性末端不一定相同，如EcoR Ⅰ、Hind Ⅱ、Kpn Ⅰ切割后形成的黏性末端各不相同，而BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，C错误；限制酶切割后可形成平末端，D正确。]
11．(2020·山东师大附中月考)用限制酶EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ和二者的混合物分别作用于一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，同时对酶切产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，酶切产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图(单位：bp)正确的是( )
A B
C D
C [
]
12．某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
A [①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。]
6/8第3课时 基因工程的基本操作程序
课标内容要求 核心素养对接
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 1.科学思维——结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。2.生命观念——运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。
一、利用表达载体构建重组DNA分子是基因工程操作的第二步
1．克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体，称为克隆载体。
2．表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体，称为表达载体。
3．构建重组DNA分子：用同种限制性内切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体，然后用DNA连接酶将它们连接起来，可完成体外重组，形成重组的DNA分子。
二、将目的基因导入受体细胞是基因工程操作的第三步
1．将目的基因导入细菌细胞
(1)感受态细胞：自然条件下，细菌的转化效率很低，通过化学和物理方法的处理可以增强细菌捕获外源DNA的能力，成为感受态细胞。
(2)方法(以大肠杆菌为例)：将大肠杆菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，细胞膜通透性改变，成为感受态细胞。再在低温条件下将大肠杆菌与重组DNA分子混合，使外源DNA黏附于受体细胞表面，最后进行短暂的热刺激处理，使外源DNA转入细胞。
2．将目的基因导入动物细胞
(1)常用方法：显微注射法。
(2)常用受体细胞：受精卵。
3．将目的基因导入植物细胞
(1)常用方法：农杆菌转化法。
(2)农杆菌特点：自然条件下，根癌农杆菌的Ti质粒上的T－DAN片段能整合到植物染色体DNA中。
(3)转化方法：将目的基因插入质粒的T－DNA中，用重组Ti质粒转化农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随T－DNA整合到植物染色体DNA中，最后通过植物组织培养技术可培育出完整的转基因植株。
三、检测目的基因及其表达产物是基因工程操作的第四步
1．通过检测DNA可确定目的基因在受体细胞内是否稳定存在。
(1)借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。
(2)PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。
①运用PCR技术检测的简要步骤是：根据目的基因的序列设计PCR引物，利用待检DNA为模板进行PCR，再通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物。
②核酸分子杂交技术
a．核酸分子杂交是指两个不同来源核酸单链的核苷酸之间碱基互补配对的过程。
b．核酸探针是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA。
c．利用探针检测目的基因的简要方法是：用化学方法使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上，然后加入探针，在适当的条件下探针与互补的目的基因片段形成双链。漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针后，若硝酸纤维素膜仍具有放射性或荧光，则可判断待检DNA中含有目的基因。
2．检测RNA、蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状，可得知目的基因是否正确表达。
(1)运用核酸分子杂交技术还可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。如果能检测到目的基因转录出的mRNA，则说明目的基因在受体细胞内成功转录。
(2)运用抗原－抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。如果能探测到目的蛋白，则说明目的基因在受体细胞内成功表达。
(3)观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．为保证目的基因在水稻细胞中表达，载体上应含有特定的复制原点。 (×)
提示：基因表达需要有启动子，复制原点就是复制起点。
2．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 (×)
提示：复制需要以复制原点为起点，启动子与终止子是转录的起止点。
3．从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。 (×)
提示：基因的表达包括转录和翻译，获得mRNA只能说明完成了转录。
4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 (√)
5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 (×)
提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。 (√)
利用表达载体构建重组DNA分子
1．表达载体的组成及作用
2．表达载体的构建步骤
目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端或平末端。一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同的黏性末端或平末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)(如图)。
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，若其没有启动子，只将目的基因导入受体细胞中将无法进行转录。
(2)目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒在插入目的基因的部位前面需要有启动子，后面需要有终止子。
(3)鉴别目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。
因此，一个基因表达载体的组成应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基因等。
(1)由于受体细胞有动物细胞、植物细胞、微生物细胞之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，所以基因表达载体在构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。
(2)基因表达载体的构建过程中，最好用同一种限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端或平末端，便于二者进行连接。但有时可用两种限制酶分别切割载体和目的基因，这样可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接，还可以确保目的基因和载体的正向连接。
1．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题。
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________________________
____________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_______________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
图(c)
[解析] (1)由题图(a)可知，BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ两种限制性内切核酸酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH Ⅰ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。
[答案] (1)Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
将目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞的方法
生物类型 方法 受体细胞 转化过程 特点
植物 农杆菌转化法 体细胞或受精卵 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达 适用于双子叶植物和裸子植物
花粉管通道法 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 适用于任何开花植物
动物 显微注射法 受精卵 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物 是采用最多、最有效的方法
微生物 Ca2＋处理法 原核细胞 Ca2＋处理微生物细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使该细胞吸收DNA分子 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，从而成为最常用的受体细胞
1．农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的T DNA片段？
提示：Ti质粒的T DNA片段可以整合到受体细胞的染色体上。
2．如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比有什么优点？
提示：(1)操作简便；(2)直接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可，其他答案合理也可)
3．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
2．(2020·山东泰安期中改编)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是( )
A．可利用花粉管通道法培育转基因植物
B．用Ca2＋处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态
C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵
D．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法
D [可利用花粉管通道法培育转基因植物，A正确；用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2＋处理法，D错误。]
3．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，正确的是( )
A．可以通过显微注射法直接将目的基因导入动物的受精卵中
B．通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择大肠杆菌比酵母菌更有优势
C．可以用PEG处理大肠杆菌将目的基因导入其细胞内
D．可以使用病毒将目的基因导入受体细胞
D [目的基因导入受体细胞前必须进行基因表达载体的构建，不能直接将目的基因导入，A错误；酵母菌细胞中有多种细胞器，作为受体细胞生产胰岛素(分泌蛋白)比大肠杆菌更有优势，B错误；大肠杆菌作为受体细胞时应使用Ca2＋进行处理，C错误；可以利用部分病毒将自身DNA整合到宿主细胞染色体上的特点构建病毒表达载体，并通过病毒的侵染将目的基因导入相关受体细胞，D正确。]
检测目的基因及其表达产物
1．在分子水平上检测目的基因及其表达产物
待检测物质 检测目的 检测方法
DNA 确定目的基因在受体细胞中是否稳定存在 借助标记基因检测、运用PCR技术鉴定、利用核酸分子杂交技术鉴定
RNA 确定目的基因 核酸分子杂交技术
蛋白质 是否正确表达 抗原—抗体杂交技术
2.常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
4．下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( )
A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
A [检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度；检测基因工程产品与天然产品的活性是否相同等。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。]
5．同一人体，所有体细胞都是由同一个受精卵有丝分裂而来的，所以人体内所有细胞所含DNA相同，且具有该个体全部的遗传物质，但是由于基因的选择性表达，不同种细胞中的mRNA和蛋白质种类有所区别，如胰岛A细胞能表达胰高血糖素基因，但不会表达胰岛素基因。关于目的基因的检测与鉴定，下列说法错误的是( )
A．要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，可采用PCR技术
B．要检测目的基因是否转录出了mRNA，采用核酸分子杂交技术
C．要检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术，此技术要提前制备好抗原
D．要进行个体生物学水平的鉴定，以确定是否赋予转基因生物相应的特性
C [检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用的方法为抗原—抗体杂交技术，此技术要提前制备好抗体(抗原为基因表达的蛋白质，可以根据抗原提前制备好抗体)。]
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体，称为表达载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。2.将目的基因导入细菌、动物细胞和植物细胞常用的方法分别为Ca2＋处理法、显微注射法和农杆菌转化法。3.借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。4.PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。5.运用核酸分子杂交技术还可以检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。6.运用抗原—抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。
1．下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是( )
A．具有复制起点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B．具有启动子，作为多肽链合成的起始信号
C．具有标记基因，有利于目的基因的初步检测
D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
B [基因表达载体必须使目的基因能够在受体细胞内进行扩增，因此要具有复制起点，A正确；基因表达载体必须使目的基因能够在受体细胞内进行表达，具有启动子(启动转录)，作为RNA合成的起始信号，B错误；具有标记基因，有利于目的基因的初步检测，如抗生素抗性基因，含目的基因的受体细胞在含抗生素的培养基上能生长，C正确；构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞内高效、稳定地表达，以获得特定的基因表达产物，D正确。]
2．(2020·山东枣庄八中月考)以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是( )
A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B．表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D．表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
B [基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。]
3．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( )
A．培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
A [水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]
4．(2020·河北唐山一中高二期中)目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，错误的是( )
A．获取目的基因的单链片段并用含放射性的物质标记后制成探针
B．可用含有目的基因的DNA探针检测基因是否转入受体细胞
C．目的基因是否转录和翻译的检测方法是DNA分子杂交技术
D．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
C [将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此作为探针，A正确。可采用DNA分子杂交技术将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素等做标记，以此作为探针，检测目的基因是否转入了受体细胞，B正确。目的基因是否转录出了mRNA的检测方法是分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，C错误。检测目的基因是否翻译成蛋白质，可从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成相应蛋白质产物，D正确。]
5．下图是将某细菌的基因导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
据图回答下列问题。
(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在________酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________序列，再通过化学方法合成所需基因。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(3)由基因A和载体B拼接形成的C通常称为________________。
(4)在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是________________________
________________________________________________________________。
[解析] (1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。
(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。
[答案] (1)逆转录 DNA聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸 (2)引物 模板(A基因) (3)基因表达载体 (4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
12/12第2课时 基因结构及目的基因的获取
课标内容要求 核心素养对接
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 1.科学思维——结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。2.生命观念——运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。
一、基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性
1．基因工程的基本操作步骤包括：获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等步骤。
2．基因结构
(1)原核基因
①编码蛋白质的核苷酸序列是连续的。
②启动子(promoter)位于基因的“上游”，有RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始。
③终止子(terminator)位于基因末端，当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束。
(2)真核基因
①真核细胞基因也具有启动子、终止子等调控序列，但是编码蛋白质的核苷酸序列是不连续的。
②编码蛋白质的序列称为外显子(exon)，外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子(intron)。
③不同基因内含子和外显子的数目及长度是不同的。
(3)真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图
①原核细胞
②真核细胞：外显子和内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA(如图)。
3．获取目的基因是基因工程操作的第一步
(1)用化学合成法合成目的基因
条件：需要已知目的基因全部序列。
缺点：成本较高，适于合成序列较短的基因。
(2)借助载体建立基因文库是获取目的基因的一种常用方法
①基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。
②利用成熟的mRNA构建cDNA文库的基本方法：
从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。最后，借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库。
(3)聚合酶链式反应(简称PCR技术)
①概念：在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。
②特点：简便、快速、灵敏。
③应用：医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等。
④条件
模板：待扩增的DNA分子。
原料：4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP。
酶：耐高温的Taq_DNA聚合酶。
引物：很短的DNA单链，与模板互补配对形成一小段DNA双链。
⑤过程：包括多次循环，每个循环分为3个步骤：a.变性：模板DNA双链在高温下(90～95 ℃)氢键断裂，解旋成2条DNA单链，这个过程称为变性。b.退火：温度降低(50～60 ℃)后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合，称为退火。c.延伸：分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的Taq_DNA聚合酶在适宜的温度(约72 ℃)下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。
⑥结果：每一次循环后DNA的量可以增加一倍，DNA呈指数形式扩增。
(4)电泳技术
①用途：该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。
②电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。
③分离物质原理：不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。
④电泳技术分离核酸原理
核酸是带有负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。
⑤凝胶电泳相关成分及作用
成分 作用
凝胶 作为介质，其孔隙起到分子筛作用
缓冲液 维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移
DNA相对分子质量标准物(DNA Marker) 一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中作为参照物
荧光或放射性染料 对DNA进行标记
亚甲基蓝 将DNA染成蓝色
二、PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1．实验原理
(1)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特定基因或DNA片段的技术，经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤，可获得大量的目的基因或DNA片段。
(2)本活动使用PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，长度为841 bp，再通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。使用亚甲基蓝对凝胶进行染色，再用75%酒精以及蒸馏水脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。
(3)本活动扩增的序列广泛存在于真菌中，多样性程度较高，常用于鉴定病原真菌，选择用于酿酒的酵母菌株，通过比对PCR产物序列推测亲缘关系。
2．材料用具
(1)PCR相关试剂：以下溶液在－20 ℃条件下冷冻保存，使用前置于冰盒内或冰块上。
①市售10×扩增缓冲液(含Mg2＋)。
②市售10 mmol/L 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。
③市售2 U/μL Taq DNA聚合酶(U为酶活力单位，定义为30 ℃、最适pH、底物浓度饱和的条件下，1 min转化1 μmol底物所需要的酶量)。
④无菌水：将双蒸水在高压灭菌锅中灭菌，制成无菌水。
⑤10 μmol/L引物A溶液：序列为5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′。用无菌水将市售引物稀释成10 μmol/L 溶液。
⑥10 μmol/L引物B溶液：序列为5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′。用无菌水将市售引物稀释成10 μmol/L 溶液。
(2)电泳相关试剂
①Tris－硼酸(TBE)电泳缓冲液：将市售50×电泳缓冲液稀释50倍。或配制5×TBE电泳缓冲液：称取54 g Tris、27.5 g硼酸溶于800 mL蒸馏水中，加入20 mL的0.5 mol/L EDTA，调节pH到8.0，加水定容至1 L，室温保存备用，使用时稀释5倍。
②市售6×上样缓冲液(loading buffer)：内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入加样孔内；含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝迁移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源。
③市售DNA相对分子质量标准物(Marker)。
(3)染色相关试剂
①0.1%亚甲基蓝溶液：称取0.1 g亚甲基蓝溶于100 mL蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛，避光保存。
②75%酒精。
③保存于4 ℃条件下的蒸馏水。
或使用0.002%亚甲基蓝溶液：将2 mL的0.1%亚甲基蓝溶液加入10 mL电泳缓冲液中，再加88 mL蒸馏水，避光保存。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。 (×)
提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
2．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。 (√)
3．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。 (×)
提示：Taq酶是耐高温的DNA聚合酶。
4．PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应。 (×)
提示：PCR反应中温度的周期性变化是为了使DNA变性、复性、延伸，即DNA链高温变性、低温退火(复性)及适温延伸。
5．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。 (×)
提示：启动子与终止子是转录的起止点。起始密码子与终止密码子是翻译的起止点。
6．真核细胞基因与原核细胞基因的区别是编码蛋白质的核苷酸序列分为外显子和内含子。 (√)
获取目的基因
1．几种获取目的基因的方法的比较
方法 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 化学合成
基因组文库 部分基因文库(如cDNA文库)
过程
优点 操作比较简单 专一性 可在短时间内大量扩增目的基因 专一性强，可产生自然界中不存在的新基因
缺点 工作量大、盲目性大、专一性差 操作过程较麻烦，技术要求过高 需要严格控制温度，技术要求高 适用范围较小
2．比较PCR技术与体内DNA复制
项目 PCR技术 体内DNA复制
相同点 原理 碱基互补配对原则
原料 四种脱氧核苷三磷酸(dNTP) 四种脱氧核苷酸
条件 均需要模板、引物、酶等
不同点 场所 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 细胞内(主要在细胞核内)
解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 解旋酶、普通的DNA聚合酶
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和的条件
结果 短时间内可形成大量的DNA片段 形成完整的DNA分子
3.PCR扩增的过程(如图)
4．PCR扩增的计算：理论上DNA数目呈指数扩增。
(1)若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。
(2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
1．PCR过程中为什么需要引物？
提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的聚合酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。
2．某同学认为PCR过程中不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由。
提示：正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链变成单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同，因此所需的温度不同。
3．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮。
1．甲、乙两图表示从某细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法正确的是( )
甲 乙
A．甲图所示方法可建立该细菌的cDNA文库
B．乙图所示方法可建立该细菌的基因组文库
C．甲图所示方法要以脱氧核苷酸为原料
D．乙图所示方法需要逆转录酶参与
D [用甲图所示方法获取的是该细菌的全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A错误；乙图表示用反转录法获得的DNA分子，只包含该细菌的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B错误；甲图所示方法中，只要利用限制性内切核酸酶将细菌原有的DNA切断即可，不需要以脱氧核苷酸为原料合成DNA，C错误；乙图所示方法中c为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。]
2．(2020·山东潍坊模拟改编)下列关于PCR的叙述，正确的是( )
A．PCR是体外复制DNA技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶
B．DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
C．第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段
D．延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸
C [PCR体外复制DNA不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B错误；第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段，这段固定长度的序列的数量呈指数扩增，C正确；PCR是在较高温度条件下进行的，该过程需要耐高温的DNA聚合酶，且PCR反应的产物是DNA，因此原料是4种游离的脱氧核苷酸，不是核糖核苷酸，也不需要ATP，D错误。]
PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1．PCR扩增
(1)PCR体系配方
成分 体积
10×扩增缓冲液 5 μL
dNTP 2 μL
引物A 4 μL
引物B 4 μL
Taq DNA聚合酶 1 μL
无菌水 32 μL
酵母细胞悬液 2 μL
总体积 50 μL
(2)PCR条件流程图
注意：使用微量移液器前，必须先装好相应的已灭菌一次性吸液枪头，避免液体进入微量移液器内部。推动按钮共有2挡停顿，一直按到底是第2挡。吸取液体时，先转动调节轮至目标体积(不要超出微量移液器量程)，按压推动按钮至第1挡并缓慢抬起吸取相应体积的液体。放出液体时，再次按压推动按钮至第2挡，液体全部流出后抬起按钮，推动卸枪头按钮卸掉用过的枪头。枪头在每吸取一种溶液后更换一次，避免用手接触枪头。
2．琼脂糖凝胶电泳
3．进行PCR反应的具体实验操作顺序应为( )
①离心使反应液集中在离心管底部
②用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
③按配方准备好各组分
④进行PCR反应
⑤设计好PCR仪的循环程序
A．②③⑤④① B．①⑤③②④
C．④②⑤③① D．③②①⑤④
D [PCR的具体操作顺序：按配方准备好各组分→用微量移液器将各组分依次加入微量离心管中→离心使反应液集中在离心管底部→设计好PCR仪的循环程序→进行PCR反应。]
4．(2020·北京实验学校高二期中)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析错误的是( )
2号：野生型植株DNA 3号：？ 4～9号：转基因植株DNA
A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B [PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。]
在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同识别序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。
本案例考查学生演绎与推理的科学思维及对实验结果交流与讨论的科学探究能力。
(1)该载体是环形DNA还是链状DNA？说明理由。(科学思维)
提示：该载体应为环形DNA，因为仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度为800 bp的DNA片段。
(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有几个？(科学思维)
提示：两种限制酶在载体上的酶切位点各有1个。
(3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离是多少？(科学思维)
提示：限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离为200 bp。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 核 心 语 句 背 诵
1.基因工程的基本操作程序包括：获取目的基因、构建重组DNA分子，将重组DNA分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等步骤。2.启动子位于基因的“上游”，有RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始；终止子位于基因末端，当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束。3.化学合成法需要已知目的基因全部序列，且成本较高，适于合成序列较短的基因。4.获取目的基因的常用方法：借助载体建立基因文库、通过聚合酶链式反应体外扩增特定的DNA。5.PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。6.PCR产物可利用电泳技术来鉴定，该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。
1．基因工程主要操作步骤的顺序是( )
①基因表达载体的构建
②将目的基因导入受体细胞
③目的基因的检测与鉴定
④目的基因的获取
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
C [基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。]
2．(2021·辽宁省适应性测试) PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是( )
A．都遵循碱基互补配对原则
B．DNA聚合酶作用的最适温度不同
C．都是边解旋边复制的过程
D．复制方式都是半保留复制
C [DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，B正确；PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。]
3．有关目的基因和基因文库的叙述，不正确的是( )
A．目的基因是指人们感兴趣、想研究的基因
B．目的基因主要是指编码蛋白质的基因
C．基因文库就是基因组文库
D．cDNA文库只包含一种生物的一部分基因
C [目的基因是指人们感兴趣、想研究的基因，A正确；目的基因主要是指编码蛋白质的基因，B正确；基因文库分为基因组文库和部分基因文库，C错误；cDNA文库只包含一种生物的一部分基因，D正确。]
4．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③逆转录法获得cDNA ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
D [可依据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等从基因文库中获取目的基因，故①不需要模板；②利用PCR技术扩增目的基因需要DNA的两条链作为模板；③反转录法获得cDNA需要mRNA作为模板；④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因时，不需要模板。]
5．(2020·山东济南质检)请回答PCR方面的有关问题：
(1)引物是扩增过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段________________。
(2)引物是子链合成延伸的基础，如图所示。从理论上推测，第二轮循环产物中________(填“出现”或“不出现”)两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(3)在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是________________。
(4)与体内DNA复制相比，PCR反应体系除引物外，还需加入__________________。
[解析] (1)PCR过程中，必须加入一小段单链DNA或RNA作为引物，结合到互补链DNA上。(2)PCR的原理是DNA复制，而DNA复制的特点是半保留复制。由图可知，引物的结合位置均不在DNA单链的末端，因此经过一次循环后产生的两个DNA分子都不等长；在第二次循环后形成的子链中出现固定长度的DNA链，但是形成的四个DNA分子都不等长；直到第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(3)在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是5′端→3′端。(4)与体内DNA复制相比，PCR反应体系除引物外，还需加入耐高温的DNA聚合酶。
[答案] (1)单链DNA或RNA (2)不出现 (3)5′端→3′端 (4)耐高温的DNA聚合酶
15/16课后素养落实(十五) 基因工程的基本操作程序
(建议用时：40分钟)
题组一 利用表达载体构建重组DNA分子
1．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是( )
A．目的基因插入位点 B．启动子
C．标记基因 D．DNA聚合酶识别位点
B [基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制起点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制起点等，还缺少启动子。启动子位于基因的首端，所以X最可能是启动子，B正确。]
2．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
C [由于基因的选择性表达，在人的肝细胞中没有胰岛素基因转录的mRNA，所以表达载体中的胰岛素基因不能通过人肝细胞mRNA逆转录获得，A错误；表达载体的复制启动于复制原(起)点，胰岛素基因的表达启动于启动子，B错误；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，C正确；启动子在胰岛素基因的转录过程中起作用，终止密码子在胰岛素基因的翻译过程中起作用，D错误。]
3．如图为某一重组质粒示意图，下列叙述不正确的是( )
A．用限制酶EcoR Ⅴ处理该质粒得到的分子共含有4个游离的磷酸基团
B．同时用限制酶EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ处理该质粒可得到3个双链DNA片段
C．在获得目的基因时应该使用的限制酶是BamH Ⅰ
D．将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞
C [限制酶EcoR Ⅴ在图中含有两个切点，用限制酶EcoR Ⅴ处理该质粒可得到2个线性DNA分子，每个线性DNA分子含有2个游离的磷酸基团，共含有4个游离的磷酸基团，A正确；限制酶EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ在图中共含有3个切点，同时用它们处理该质粒可得到3个双链DNA分子，B正确；在获得目的基因时，不应该使用限制酶BamH Ⅰ，若使用该限制酶，则会破坏目的基因，C错误；将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞，D正确。]
题组二 将目的基因导入受体细胞
4．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( )
选项 受体细胞 导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 大肠杆菌 农杆菌转化法
C 羊受精卵 显微注射法
D 拟南芥细胞 农杆菌转化法
B [将目的基因导入棉花细胞可采用花粉管通道法，如我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入大肠杆菌细胞，常采用Ca2＋处理法，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射法是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；拟南芥是双子叶植物，双子叶植物和裸子植物常采用农杆菌转化法导入目的基因，D正确。]
5．基因工程为花卉育种提供了新的技术保障。如图为花卉育种的过程(字母代表相应的物质或结构，序号代表过程或方法)。下列说法不正确的是( )
A．①过程需要的酶有限制酶和DNA连接酶
B．②过程常用的方法是农杆菌转化法
C．③、④过程为脱分化和再分化，该过程体现了植物细胞的全能性
D．转基因生物DNA上是否插入目的基因，可用抗原—抗体杂交技术检测
D [①过程是构建基因表达载体，需要的酶有限制酶和DNA连接酶，A正确。将基因表达载体导入植物细胞中常用农杆菌转化法，B正确。③、④过程为脱分化和再分化，该过程体现了植物细胞的全能性，C正确。检测DNA是否插入生物体内，应用DNA分子杂交技术，D错误。]
6．基因工程中，受体细胞的不同，导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题。
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入________细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌________质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染____________植物。农杆菌侵染植物，能够将目的基因插入植物细胞的__________________上。
(2)将重组质粒导入动物细胞，常采用__________的方法。将用重组质粒转入大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转入大肠杆菌时，常先用__________处理大肠杆菌，使较多的细胞成为__________细胞以利于表达载体的进入。
(3)目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变，属于可遗传变异中的________(变异类型)。
[解析] (1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染单子叶植物。农杆菌侵染植物后，能够将Ti质粒上的T DNA携带的目的基因插入植物细胞的染色体DNA上。
(2)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用Ca2＋处理大肠杆菌，使较多的细胞成为感受态细胞以利于表达载体的进入。
(3)基因工程的原理为基因重组。
[答案] (1)植物 Ti 单子叶 染色体DNA
(2)显微注射 Ca2＋ 感受态
(3)基因重组
题组三 检测目的基因及其表达产物
7．棉花产业在我国国民经济发展中占有举足轻重的地位，为了抵抗虫害，我国培育成了拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，棉田生态环境得到改善。下列判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是( )
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D．检测目的基因的表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
A [A项属于个体生物学水平的鉴定，不属于分子检测。B项为分子检测，利用DNA分子杂交技术，观察目的基因能否与DNA探针进行杂交，形成杂交带；C项为分子检测，利用分子杂交技术，观察目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交，形成杂交带；D项为分子检测，利用抗原与抗体杂交的原理，检测目的基因的表达产物能否与特定抗体形成杂交带。]
8．噬菌体抗体库技术是指将人的全部抗体基因插入噬菌体的基因组中，然后让该噬菌体感染大肠杆菌，最终使抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成含有全套抗体谱的噬菌体抗体库。请回答下列问题。
(1)人体内的抗体是在________(填细胞名称)中合成后，以胞吐的方式分泌到内环境中的。
(2)若要获取人的抗体基因，可以从细胞中提取相应的RNA，通过逆转录过程获取________________片段，再合成目的基因。采用PCR技术扩增目的基因的过程中，需要的物质除模板链、四种脱氧核苷酸外，还需要____________________。
(3)构建重组DNA分子的目的是________________________。在噬菌体抗体库的构建过程中，是否需要利用CaCl2处理大肠杆菌以制备感受态细胞？________。请写出原因：_______________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)检测大肠杆菌转录出的相应RNA时应采用____________技术，即从原核细胞中提取RNA，以________________________为探针，与RNA杂交。该技术的原理是________________________________。
[解析] (1)人体内的抗体在浆细胞中合成后，以胞吐的方式分泌到内环境中。
(2)从人的细胞中提取抗体基因的RNA，通过逆转录过程获取cDNA片段，再合成目的基因。采用PCR技术扩增目的基因的过程中，需要的物质除模板链、四种脱氧核苷酸外，还需要引物和耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
(3)构建重组DNA分子(基因表达载体)的目的是使人的抗体基因在大肠杆菌细胞中稳定表达，并能传递给下一代。由于噬菌体可以侵染大肠杆菌，将重组DNA分子注入大肠杆菌，因此在噬菌体抗体库的构建过程中，不需要利用CaCl2处理大肠杆菌以制备感受态细胞。
(4)检测大肠杆菌转录出的相应RNA时应采用分子杂交技术，即从原核细胞中提取RNA，以用放射性同位素标记的目的基因(放射性同位素标记的抗体基因)为探针，与RNA杂交。该技术的原理是碱基互补配对。
[答案] (1)浆细胞
(2)cDNA 引物和耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
(3)使人的抗体基因在大肠杆菌细胞中稳定表达，并能传递给下一代 不需要 噬菌体可以侵染大肠杆菌，并将重组DNA分子注入大肠杆菌
(4)分子杂交 放射性同位素标记的目的基因(放射性同位素标记的抗体基因) 碱基互补配对
9．下列关于基因组文库和cDNA文库的叙述，不正确的是( )
A．基因组文库和cDNA文库中的所有基因都能实现物种之间的基因交流
B．基因组文库含有某种生物的全部基因，而cDNA文库含有某种生物的部分基因
C．基因组文库中的基因含有启动子和内含子，而cDNA文库中的基因无启动子和内含子
D．根据基因中的核苷酸序列、基因在染色体上的位置可从基因文库中获取目的基因
A [基因组文库中的部分基因可以实现物种之间的基因交流，而cDNA文库中的所有基因都能实现物种之间的基因交流，A错误；基因组文库含有某种生物的全部基因，而cDNA文库含有某种生物的部分基因，B正确；基因组文库中的基因含有启动子和内含子，而cDNA文库中的基因无启动子和内含子，C正确；从基因文库中获取目的基因时，可根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取，D正确。]
10．利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用的原料是四种核糖核苷酸
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用PCR技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞
D [过程①是以mRNA为模板合成DNA的过程，即逆转录过程，需要使用的原料是四种游离的脱氧核苷酸，A错误；过程②表示利用PCR技术，扩增目的基因，在此过程中，不需要解旋酶，是通过控制温度来达到解旋的目的，B错误；利用氯化钙处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，C错误；检测目的基因是否成功导入受体细胞的染色体DNA上，可以采用PCR技术，D正确。]
11．如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．若⑤表现出抗虫性状则说明植株发生了可遗传变异
D [构建表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，故A项错误。③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA不是整合到受体细胞的染色体上，而是整合到受体细胞染色体的DNA分子上，故B项错误。染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，故C项错误。若植株表现出抗虫性状，说明目的基因成功导入受体细胞并成功表达，该过程中发生了基因重组，为可遗传变异，故D项正确。]
12．研究者利用生物技术培育出了乳铁蛋白肽和人干扰素的双转基因奶牛新品种，现分别将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段制成探针，分别与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的RNA进行杂交，结果如下表所示。下列说法错误的是( )
探针 乳腺细胞 口腔上皮细胞 蹄部细胞
乳铁蛋白肽基因探针 出现杂交带 未出现杂交带 未出现杂交带
人干扰素基因探针 出现杂交带 出现杂交带 出现杂交带
A.乳铁蛋白肽基因只在转基因奶牛的乳腺细胞中表达
B．人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达
C．表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的种类不同
D．乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是有遗传效应的DNA片段
C [由题意可知，利用乳铁蛋白肽基因探针分别与不同细胞中的RNA进行杂交，发现只有乳腺细胞能出现杂交带，说明该基因只在转基因奶牛的乳腺细胞中表达，A正确；利用人干扰素基因探针分别与不同细胞中的RNA进行杂交，发现三种细胞都能出现杂交带，说明该基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达，B正确；两种基因探针所含的脱氧核苷酸的种类相同，C错误；基因通常是有遗传效应的DNA片段，D正确。]
13．农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答下列问题。
(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是___________________，需用________________“缝合”双链DNA片段的平末端。
(2)目的基因是指________________。由过程②形成的基因表达载体中， 目的基因的上游具有________，它是________识别和结合的部位。
(3)过程③常用________处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是________________________________________。
(4)可通过________技术检测试管苗的染色体DNA上是否插入了目的基因。
[解析] (1)Ti质粒具有多种限制酶切割位点，不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。
(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的首端具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。
(3)过程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。
(4)检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因常采用PCR技术。
[答案] (1)不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列
T4 DNA连接酶
(2)编码蛋白质的基因 启动子 RNA聚合酶
(3)Ca2＋(CaCl2溶液) 用于鉴定和筛选导入了基因表达载体的农杆菌
(4)PCR
8/9课后素养落实(十四) 基因结构及目的基因的获取
(建议用时：40分钟)
题组一 获取目的基因是基因工程操作的第一步
1．下列有关获取目的基因的叙述错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
A [目的基因主要指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。]
2．(2020·山东潍坊期中改编)下列关于PCR的说法，错误的是( )
A．PCR是体外复制DNA的技术
B．PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料
C．TaqDNA聚合酶要具有耐高温的特点
D．PCR利用的是DNA的热变性原理
B [PCR是体外复制DNA的技术，A正确；PCR过程中需要一种模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料，还需要缓冲液、TaqDNA聚合酶等，B错误；TaqDNA聚合酶具有耐高温的特点，C正确；PCR利用的是DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，D正确。]
3．下列关于目的基因获取的描述，不正确的是( )
A．cDNA文库比基因组文库大
B．利用PCR技术扩增，可在短时间内大量扩增目的基因
C．双链DNA受热变性后解旋为单链
D．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可直接人工合成
A [cDNA文库属于部分基因文库，比基因组文库小，选项A错误；利用PCR技术扩增，可在短时间内大量扩增目的基因，选项B正确；双链DNA受热变性后解旋为单链，选项C正确；如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可直接人工合成，选项D正确。]
4．某基因比较小，且核苷酸序列已知，获得该基因的最佳方法是( )
A．以mRNA为模板逆转录合成DNA
B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选
D．先建立基因文库，再从中筛选
B [目的基因的获取方法主要有三种：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成。对于比较小且核苷酸序列已知的目的基因，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。]
5．如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需要酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
A [这三种方法都是在体外进行的，且都需要酶(方法a需要反转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。]
6．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
[解析] (1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案] (1)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(2)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
7．为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。如图所示是获取植酸酶基因的流程。
据图回答：
(1)图中基因组文库________(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文库。
(2)B过程需要的酶是________。
(3)要大量获取目的基因Ⅰ和目的基因Ⅱ，可以在体外利用________技术进行扩增，该过程中所用的DNA聚合酶的显著特点是________。
[解析] 任何生物的基因组文库都大于cDNA文库。B过程是逆转录过程，故需要的酶应该是逆转录酶。要大量获取目的基因Ⅰ和目的基因Ⅱ，可以在体外利用PCR技术进行扩增，该过程中所用的DNA聚合酶的显著特点是耐高温。
[答案] (1)大于 (2)逆转录酶 (3)PCR 耐高温
题组二 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
8．PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种成分的优化组合，相关叙述错误的是( )
A．反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否
B．设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量
C．TaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物的增多
D．目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置
C [PCR体外扩增需要DNA作模板，所以反应体系中模板DNA的量和纯度会影响PCR的成功与否，A正确；设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量，以保证引物能与目的基因的特定序列识别，且不能出现引物内部或引物之间的碱基互补配对，B正确；TaqDNA聚合酶的浓度过低，则扩增效率较低，扩增产物减少，若引物过短，非特异性扩增产物增加，C错误；由于PCR扩增需要在引物的下游延伸子链，所以DNA聚合酶只能特异性的催化复制处于两种引物之间的DNA序列，即目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置，D正确。]
9．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则下列相关叙述正确的是( )
A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B．共需2n＋1－2个引物参与子代DNA分子的合成
C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16
B [只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B正确；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D错误。]
10．(2020·北京通州区期末)如图表示基因工程中获取目的基因的示意图，下列叙述错误的是( )
A．①过程的完成需要逆转录酶
B．②过程需用限制性内切核酸酶
C．目前获取目的基因的方法只有两种
D．cDNA文库的构建需要提前了解目的基因的有关信息
C [①为逆转录过程，完成该过程需要逆转录酶，A正确；②表示将DNA分子切割，因此需用限制性内切核酸酶，B正确；目前获取目的基因的方法有从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、利用PCR扩增等，C错误；cDNA文库的构建需要首先获得相应的mRNA，需要提前了解能表达目的基因的细胞等有关信息，D正确。]
11．下列关于PCR技术的叙述，错误的是( )
A．PCR即聚合酶链式反应，利用其可获取大量目的基因
B．PCR可以在仪器中自动完成
C．利用PCR扩增目的基因时要知道目的基因的部分序列
D．利用PCR扩增目的基因时必须用解旋酶解开双链DNA
D [PCR即聚合酶链式反应，是体外合成DNA的方式，利用其可获取大量目的基因，A正确；PCR可以在仪器(PCR仪)中自动完成，B正确；利用PCR扩增目的基因时要知道目的基因的部分序列，以便设计引物与之结合，C正确；利用PCR扩增目的基因时借助高温解开双链DNA，D错误。]
12．(2020·北京等级考)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋② C．③＋② D．③＋④
B [图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，即B正确，A、C、D错误。]
13．(2020·章丘四中月考)目前广泛应用的新型冠状病毒的检测方法是实时荧光RT PCR技术。RT PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．与该mRNA结合的引物，可以是A也可以是B
B．引物A与引物B的基本单位都是脱氧核苷酸
C．过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
D．该反应体系中应加入逆转录酶、Taq酶等物质
A [通过图示可知，与该mRNA结合的引物，是引物A，A错误；引物A与引物B是一段DNA序列，其基本单位都是脱氧核苷酸，B正确；过程Ⅱ为PCR的反应阶段，通过控制温度的变化实现变性、退火、延伸，实现目标序列的循环扩增，C正确；RT PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、四种脱氧核糖核苷酸、逆转录酶、Taq酶等物质，D正确。]
14．如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种______________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；Taq DNA聚合酶的作用是催化__________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′－AACTATGCGAGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATGCTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGTTCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGCCGAGTAC－3′
[解析] (1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′－羟基和5′－磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物的3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为5′－AATT，3′端序列应为AATT－3′，B正确。
[答案] (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板合成的DNA子链的延伸 (3)②④ (4)B
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