高中生物人教版（2019）选择性必修3 2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体（共44张ppt)
文档属性
| 名称 | 高中生物人教版（2019）选择性必修3 2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体（共44张ppt) |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 38.3MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-04-22 19:03:58 | ||
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文档简介
(共44张PPT)
第2节 动物细胞工程
01
动物细胞融合技术
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
一、动物细胞融合技术
1、定义：
指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2、原理：
细胞膜的流动性
诱导 融合
3、结果：
融合形成杂交细胞
具有原来两个细胞的遗传信息
4、融合方法：
诱导 融合
与植物原生质体融合的方法相同
物理方法：
电融合法、离心法
化学方法：
聚乙二醇（PEG）融合法
生物方法：
灭活病毒诱导法
（动物细胞融合特有）
【问题1】灭活病毒诱导细胞融合的原理
（1）灭活：
（2）灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
动物细胞融合完成的标志？
细胞核的融合
【问题2】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
诱导 融合
5. 意义：
6. 应用：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
（1）与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒 （ ）
（2）灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 （ ）
（3）二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞 （ ）
判断常考语句，澄清易混易错
下列关于动物细胞融合的说法,错误的是 ( )
A.动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的多核细胞称为杂交细胞
B.动物细胞融合已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段
C.常用于诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等
D.细胞融合技术突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能
A
一、概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
单克隆抗体技术
产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏
反复
注射
动物体内
抗原
多种浆细胞
多种抗体（血清）
每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体
体内产生的特异性抗体多达百万种
缺点
单克隆抗体技术
1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
体液免疫
2.抗体主要分布在哪里？
血清
3.早期获得抗体的方法有哪些
动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。
面临问题：
在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。因为单个B淋巴细胞寿命有限，又因为能产生抗体的B淋巴细胞属于高度分化的细胞，不能无限繁殖不可能无限增殖。
如何解决这个问题呢？
米尔斯坦
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
分泌
抗体
无限
增殖
杂交瘤细胞
＋
＝
产生抗体
大量增殖
在体外培养条件下，能大量增殖。
动物细胞融合技术
单克隆抗体的制备过程
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导
融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
不是为了得到抗体！
PEG融合法、
电融合法、
灭活病毒诱导法
思考：
①不注射抗原，直接提取B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，能得到单克隆抗体吗？给小鼠注射特定抗原的目的是什么？
能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。
不能
实质是浆细胞
若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
（杂交瘤细胞）
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
第一次筛选
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？
培养基中加入氨基蝶呤。
资料分析：
a.细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
b.免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。c.鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死。
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
经多次筛选
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
克隆化培养、抗体检测
多孔细胞培养板
96孔板
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
①将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。
②然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
检测原理？
抗原—抗体杂交技术
将杂交瘤细胞群稀释，
约每孔1个进行培养（克隆化培养）
一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）
经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，
就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）
AB1、AB2、AB3 ……
多孔细胞培养板
第二次筛选：筛选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞
方法：克隆化培养和专一抗体检测
阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔内
体内培养
细胞培养液提取
小鼠腹水中提取
特异性强，
灵敏度高，
可大量制备
单克隆抗体
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低，规模小，产量少
需要人为控制培养条件，成本相对较高
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因
筛选 目的 筛选出？ 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
诱导融合后得到多种融合
细胞，还有未融合的细胞等
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的
刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤
细胞中有能产生其他抗体的细胞
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基
克隆化培养
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
单克隆抗体
诱导融合
单克隆抗体小结
动物细胞融合
动物细胞培养
筛选一
筛选二
多次筛选
特异性强、灵敏度高、可大量制备
细胞增殖
细胞膜具有流动性
既能大量繁殖
又能产生专一抗体
（1）第一次筛选的目的：
（2）如何筛选：
（3）筛选原理：
（4）杂交瘤细胞的特点：
（5）第二次筛选的目的：
（6）如何筛选：
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有
同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
单克隆抗体及其应用
获得足够数量的能分泌所需抗体杂交瘤细胞
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
（7）选择抗体检测呈___性的杂交瘤
细胞，即_______________________
（8）抗体检测原理__________________________________
阳
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养____________________________
②小鼠腹腔内培养____________________________
（11）单克隆抗体的优点
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
女性怀孕后会分泌一种糖蛋白——人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。
①作为诊断试剂：(最广泛的用途)
单克隆抗体及其应用
二、单克隆抗体及其应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。
问题：但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害
解决方法：抗体一药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
抗体
药物
接头
细胞凋亡
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
用于疾病的治疗和运载药物 (主要用于癌症的治疗)
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物(放射性同位素/细胞毒素）
单克隆抗体：
(1).特异性强、灵敏度高
生物导弹
单抗
抗癌药物
原理：
组成：
(2).疗效高、毒副作用小 ：不损伤正常细胞 ，减少剂量
导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置
抗癌药物：
杀死癌细胞
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
ADC的抗体和药物各具有什么作用？
讨论1
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。
一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
讨论2
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
讨论3
4. 单克隆抗体在临床上还有哪些应用？
提示： 单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的细微差异；
（2）与特定抗原发生特异性结合；
（3）可以大量制备。
单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
【网络构建】
（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（ ）
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（ ）
（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（ ）
判断常考语句，澄清易混易错
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
3．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的细胞毒性T细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞
D
4．抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是 （ ）
A．ADC可通过主动运输
进入肿瘤细胞
B．抗体进入细胞后激活
溶酶体酶，导致细胞凋亡
C．单克隆抗体携带细胞
毒素与肿瘤细胞特异性结合
D．肿瘤细胞凋亡是细胞
主动死亡的过程，所以不
会产生新的蛋白质
C
第2节 动物细胞工程
01
动物细胞融合技术
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
一、动物细胞融合技术
1、定义：
指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2、原理：
细胞膜的流动性
诱导 融合
3、结果：
融合形成杂交细胞
具有原来两个细胞的遗传信息
4、融合方法：
诱导 融合
与植物原生质体融合的方法相同
物理方法：
电融合法、离心法
化学方法：
聚乙二醇（PEG）融合法
生物方法：
灭活病毒诱导法
（动物细胞融合特有）
【问题1】灭活病毒诱导细胞融合的原理
（1）灭活：
（2）灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
动物细胞融合完成的标志？
细胞核的融合
【问题2】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
诱导 融合
5. 意义：
6. 应用：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
（1）与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒 （ ）
（2）灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 （ ）
（3）二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞 （ ）
判断常考语句，澄清易混易错
下列关于动物细胞融合的说法,错误的是 ( )
A.动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的多核细胞称为杂交细胞
B.动物细胞融合已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段
C.常用于诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等
D.细胞融合技术突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能
A
一、概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
单克隆抗体技术
产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏
反复
注射
动物体内
抗原
多种浆细胞
多种抗体（血清）
每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体
体内产生的特异性抗体多达百万种
缺点
单克隆抗体技术
1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
体液免疫
2.抗体主要分布在哪里？
血清
3.早期获得抗体的方法有哪些
动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。
面临问题：
在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。因为单个B淋巴细胞寿命有限，又因为能产生抗体的B淋巴细胞属于高度分化的细胞，不能无限繁殖不可能无限增殖。
如何解决这个问题呢？
米尔斯坦
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
分泌
抗体
无限
增殖
杂交瘤细胞
＋
＝
产生抗体
大量增殖
在体外培养条件下，能大量增殖。
动物细胞融合技术
单克隆抗体的制备过程
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导
融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
不是为了得到抗体！
PEG融合法、
电融合法、
灭活病毒诱导法
思考：
①不注射抗原，直接提取B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，能得到单克隆抗体吗？给小鼠注射特定抗原的目的是什么？
能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。
不能
实质是浆细胞
若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
（杂交瘤细胞）
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
第一次筛选
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？
培养基中加入氨基蝶呤。
资料分析：
a.细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
b.免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。c.鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死。
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
经多次筛选
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
克隆化培养、抗体检测
多孔细胞培养板
96孔板
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
①将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。
②然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
检测原理？
抗原—抗体杂交技术
将杂交瘤细胞群稀释，
约每孔1个进行培养（克隆化培养）
一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）
经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，
就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）
AB1、AB2、AB3 ……
多孔细胞培养板
第二次筛选：筛选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞
方法：克隆化培养和专一抗体检测
阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔内
体内培养
细胞培养液提取
小鼠腹水中提取
特异性强，
灵敏度高，
可大量制备
单克隆抗体
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低，规模小，产量少
需要人为控制培养条件，成本相对较高
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因
筛选 目的 筛选出？ 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
诱导融合后得到多种融合
细胞，还有未融合的细胞等
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的
刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤
细胞中有能产生其他抗体的细胞
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基
克隆化培养
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
单克隆抗体
诱导融合
单克隆抗体小结
动物细胞融合
动物细胞培养
筛选一
筛选二
多次筛选
特异性强、灵敏度高、可大量制备
细胞增殖
细胞膜具有流动性
既能大量繁殖
又能产生专一抗体
（1）第一次筛选的目的：
（2）如何筛选：
（3）筛选原理：
（4）杂交瘤细胞的特点：
（5）第二次筛选的目的：
（6）如何筛选：
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有
同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
单克隆抗体及其应用
获得足够数量的能分泌所需抗体杂交瘤细胞
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
（7）选择抗体检测呈___性的杂交瘤
细胞，即_______________________
（8）抗体检测原理__________________________________
阳
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养____________________________
②小鼠腹腔内培养____________________________
（11）单克隆抗体的优点
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
女性怀孕后会分泌一种糖蛋白——人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。
①作为诊断试剂：(最广泛的用途)
单克隆抗体及其应用
二、单克隆抗体及其应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。
问题：但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害
解决方法：抗体一药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
抗体
药物
接头
细胞凋亡
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
用于疾病的治疗和运载药物 (主要用于癌症的治疗)
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物(放射性同位素/细胞毒素）
单克隆抗体：
(1).特异性强、灵敏度高
生物导弹
单抗
抗癌药物
原理：
组成：
(2).疗效高、毒副作用小 ：不损伤正常细胞 ，减少剂量
导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置
抗癌药物：
杀死癌细胞
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
ADC的抗体和药物各具有什么作用？
讨论1
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。
一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
讨论2
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
讨论3
4. 单克隆抗体在临床上还有哪些应用？
提示： 单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的细微差异；
（2）与特定抗原发生特异性结合；
（3）可以大量制备。
单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
【网络构建】
（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（ ）
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（ ）
（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（ ）
判断常考语句，澄清易混易错
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
3．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的细胞毒性T细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞
D
4．抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是 （ ）
A．ADC可通过主动运输
进入肿瘤细胞
B．抗体进入细胞后激活
溶酶体酶，导致细胞凋亡
C．单克隆抗体携带细胞
毒素与肿瘤细胞特异性结合
D．肿瘤细胞凋亡是细胞
主动死亡的过程，所以不
会产生新的蛋白质
C