3.1重组DNA的基本工具课件2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3(课件共38张PPT)
文档属性
| 名称 | 3.1重组DNA的基本工具课件2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3(课件共38张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 4.9MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-04-23 21:24:16 | ||
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文档简介
(共38张PPT)
我国是棉花的生产和消费大国。在棉花种植过程中常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最常见。
大量施用农药
×
能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？
抗虫基因
转基因
基因工程
基因工程
Genetic engineering
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
自主学习
阅读书本P67，完成下列问题
1.基因工程的概念：
a.操作原理：
b.操作水平：
c.操作环境：
d.操作对象：
e.操作结果：
转基因
新的生物类型
分子水平
重组DNA技术
基因重组
DNA分子水平
生物体外
基因
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
1944年艾弗里证明了遗传物质是DNA。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1970年，发现了第一个限制性核酸内切酶。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物批准上市。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1967年，科学家发现，质粒有自我复制能力，可以转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1973年，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR。
基因工程发展历程
History of genetic engineering
环状病毒侵染的番木瓜
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
3.1 重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
DNA连接酶—“分子缝合针”
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
基因工程
Genetic engineering
分子工具
“分子运输车”：能将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
“分子手术刀”：能准确切割DNA分子
“分子缝合针”：能将DNA片段再连接起来
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
细菌
细菌
细菌
限制性内切酶
限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
全称——
简称——
1.全称和简称：
自主学习
阅读书本P71，完成下列问题
限制性内切核酸酶
限制酶
2.来源：
主要从原核生物中分离纯化出来
3.种类：
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
4.作用：
5.作用结果：
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
EcoR Ⅰ限制酶的切割
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
Sma Ⅰ限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
Sma Ⅰ限制酶
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
EcoR Ⅰ限制酶（G和A之间切割）
Sma Ⅰ限制酶（C和G之间切割）
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
黏性末端
平末端
（1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链的分别切开时，产生的是黏性末端。
（2）当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
思考：限制性内切核酸酶切割的是DNA的哪个结构呢？
中心轴线
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
知识回顾
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
DNA的结构特点：
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链
按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
磷酸二酯键
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
全称——
简称——
1.全称和简称：
自主学习
阅读书本P71，完成下列问题
限制性内切核酸酶
限制酶
2.来源：
主要从原核生物中分离纯化出来
3.种类：
数千种
4.作用：
5.作用结果：
1.能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
2.使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
作用部位
产生黏性末端或平末端
小资料：限制酶名字的由来
第一个字母为属名，用大写；
第二、三字母为种名，用小写；
第四字母为株
用罗马数字表示发现的顺序
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
EcoRI
属
种
株
序
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
合作探究
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
T
A
T
A
EcoRI
EcoRI
EcoRI
C
G
G
C
C
G
T
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A
A
A
A
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G
C
G
C
G
C
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A
A
A
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A
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A
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
1.作用：
2.类型：
自主学习
阅读书本P72，完成下列问题
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
不是连接氢键
（氢键的形成不需要酶的催化）
类型 来源 作用 相同点 差别
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端
(效率较低)
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
知识归纳
比较DNA连接酶与限制酶
破坏磷酸二酯键
目前发现1000多种
大肠杆菌和T4噬菌体
主要是原核生物
形成完整的重组DNA分子
具有互补黏性末端或平末端的DNA片段
基因工程的基因表达载体的构建
提取目的基因和切割载体
具有互补黏性末端或平末端的DNA片段
来源
DNA连接酶
限制酶
底物
作用
产物
应用
种类
具有特定识别序列和切割位点的双链DNA
形成磷酸二酯键
E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
知识归纳
比较DNA连接酶与DNA聚合酶
形成磷酸二酯键
都是蛋白质
无模板
DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
合成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
具有互补黏性末端或平末端的DNA片段
怎么将这样的外源基因送入细胞内呢？
模板
DNA连接酶
DNA聚合酶
底物
作用
产物
应用
化学本质
4种游离的脱氧核苷酸
形成磷酸二酯键
都是蛋白质
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
自主学习
阅读书本P72，完成下列问题
1.种类：
3.常用载体：
2.作用：
质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
将目的基因送入细胞。
质粒
来源：
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
为什么质粒能作为载体呢？它具有什么特点？
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
合作探究
观察图片1-1，思考讨论质粒的特点及相关作用
复制原点
目的基因
插入位点
氨苄青霉素抗性基因
1.能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
外源DNA片段（目的基因）插入其中
2.有一个至多个限制酶切割位点
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
.
.
.
便于重组DNA分子的筛选
3.具有标记基因
除了氨苄青霉素抗体基因外，四环素抗体基因也可作为标记基因。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
图1-1
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
合作探究
载体的选择
质粒、噬菌体、动、植物病毒等载体来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源 DNA片段的大小上也有很大差别。
思考下列基因的转入需要哪种载体？
1.计划让大肠杆菌表达人类激素？
2.计划让转基因羊的乳汁里含有人的凝血蛋白？
质粒、噬菌体
动物病毒
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
质粒
DNA分子
用EcoRⅠ限制酶切割
用EcoRⅠ限制酶切割
用DNA连接酶粘合
The basic tools of recombinant DNA technology
重组DNA技术的基本工具
思考讨论
载体的选择
请同学找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
The basic tools of recombinant DNA technology
重组DNA技术的基本工具
选择限制酶切割位点的基本原则
切割目的基因时：
切割质粒时：
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
DNA 的 粗 提 取 与 鉴 定
Rough extraction and identification of DNA
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
一、实验原理
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
观察左图，尝试描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
用高浓度的盐溶液（2mol/L的NaCl溶液）溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
用低浓度的盐溶液（0.14mol/L的NaCl溶液）使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。
取过滤液
取过滤物
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
2.DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质能溶于酒精。
3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
酶——蛋白酶
高温——大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，但DNA在
80℃以上才会变性
洗涤剂——能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响
4.DNA的鉴定
DNA+二苯胺 蓝色物质
沸水浴
对照组
实验组
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
二、实验设计
（一）实验材料的选取
那么应该选择什么样的材料呢？
思考：上述材料中哪些不能进行选择？为什么？
凡是含有DNA的生物材料都可，但是选用富含DNA的材料成功率会更高。
材料用具：
新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
（二）实验步骤
1.破碎细胞，获取DNA的滤液
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
研磨
注意事项：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶，研磨效果好（有利于充分研磨）；研磨不宜太用力
思考：若是动物细胞，该如何获取DNA滤液？
吸水涨破
2.去除滤液中的杂质
a.漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液；
b.也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
（核蛋白、脂质、多糖和RNA等杂质）
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
3.DNA的析出
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
4.DNA的鉴定
DNA滤液+同体积冷却的95%酒精
静置2~3min
白色絮状物
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
思考：为什么要沿一个方向搅拌？
丝状物或沉淀物+2mol/L的NaCl溶液5mL
二苯胺
加热
冷却后观察颜色变化
实验组
对照组
水浴加热
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
合作探究
1.为什么要提取出白色丝状物？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
鉴定结果呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶，以下说法正确的是 ( )
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特基因的DNA探针
A
3.图1为某种质粒结构简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是( )
A.在基因工程中若只用一种限制酶
完成对质粒和外源DNA的切割，则可选
EcoRⅠ
B.如果将一个外源DNA分子和一个
质粒分别用 EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoRⅠ酶切点有1个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理
D.质粒是一种结构很小的、能自主复制的环状DNA，是基因工程中最常用的载体
B
我国是棉花的生产和消费大国。在棉花种植过程中常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最常见。
大量施用农药
×
能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？
抗虫基因
转基因
基因工程
基因工程
Genetic engineering
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
自主学习
阅读书本P67，完成下列问题
1.基因工程的概念：
a.操作原理：
b.操作水平：
c.操作环境：
d.操作对象：
e.操作结果：
转基因
新的生物类型
分子水平
重组DNA技术
基因重组
DNA分子水平
生物体外
基因
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
1944年艾弗里证明了遗传物质是DNA。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1970年，发现了第一个限制性核酸内切酶。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物批准上市。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1967年，科学家发现，质粒有自我复制能力，可以转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1973年，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR。
基因工程发展历程
History of genetic engineering
环状病毒侵染的番木瓜
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
3.1 重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
DNA连接酶—“分子缝合针”
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
基因工程
Genetic engineering
分子工具
“分子运输车”：能将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
“分子手术刀”：能准确切割DNA分子
“分子缝合针”：能将DNA片段再连接起来
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
细菌
细菌
细菌
限制性内切酶
限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
全称——
简称——
1.全称和简称：
自主学习
阅读书本P71，完成下列问题
限制性内切核酸酶
限制酶
2.来源：
主要从原核生物中分离纯化出来
3.种类：
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
4.作用：
5.作用结果：
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
EcoR Ⅰ限制酶的切割
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。
A
A
G
T
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C
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G
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C
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
Sma Ⅰ限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
Sma Ⅰ限制酶
C
C
C
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G
G
G
C
C
C
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限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
A
A
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A
A
G
A
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EcoR Ⅰ限制酶（G和A之间切割）
Sma Ⅰ限制酶（C和G之间切割）
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
黏性末端
平末端
（1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链的分别切开时，产生的是黏性末端。
（2）当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
思考：限制性内切核酸酶切割的是DNA的哪个结构呢？
中心轴线
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
知识回顾
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
DNA的结构特点：
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链
按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
磷酸二酯键
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
全称——
简称——
1.全称和简称：
自主学习
阅读书本P71，完成下列问题
限制性内切核酸酶
限制酶
2.来源：
主要从原核生物中分离纯化出来
3.种类：
数千种
4.作用：
5.作用结果：
1.能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
2.使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
作用部位
产生黏性末端或平末端
小资料：限制酶名字的由来
第一个字母为属名，用大写；
第二、三字母为种名，用小写；
第四字母为株
用罗马数字表示发现的顺序
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
EcoRI
属
种
株
序
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
合作探究
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
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A
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A
EcoRI
EcoRI
EcoRI
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G
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A
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T
G
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T
A
T
A
会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
1.作用：
2.类型：
自主学习
阅读书本P72，完成下列问题
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
不是连接氢键
（氢键的形成不需要酶的催化）
类型 来源 作用 相同点 差别
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端
(效率较低)
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
知识归纳
比较DNA连接酶与限制酶
破坏磷酸二酯键
目前发现1000多种
大肠杆菌和T4噬菌体
主要是原核生物
形成完整的重组DNA分子
具有互补黏性末端或平末端的DNA片段
基因工程的基因表达载体的构建
提取目的基因和切割载体
具有互补黏性末端或平末端的DNA片段
来源
DNA连接酶
限制酶
底物
作用
产物
应用
种类
具有特定识别序列和切割位点的双链DNA
形成磷酸二酯键
E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
知识归纳
比较DNA连接酶与DNA聚合酶
形成磷酸二酯键
都是蛋白质
无模板
DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
合成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
具有互补黏性末端或平末端的DNA片段
怎么将这样的外源基因送入细胞内呢？
模板
DNA连接酶
DNA聚合酶
底物
作用
产物
应用
化学本质
4种游离的脱氧核苷酸
形成磷酸二酯键
都是蛋白质
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
自主学习
阅读书本P72，完成下列问题
1.种类：
3.常用载体：
2.作用：
质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
将目的基因送入细胞。
质粒
来源：
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
为什么质粒能作为载体呢？它具有什么特点？
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
合作探究
观察图片1-1，思考讨论质粒的特点及相关作用
复制原点
目的基因
插入位点
氨苄青霉素抗性基因
1.能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
外源DNA片段（目的基因）插入其中
2.有一个至多个限制酶切割位点
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
.
.
.
便于重组DNA分子的筛选
3.具有标记基因
除了氨苄青霉素抗体基因外，四环素抗体基因也可作为标记基因。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
图1-1
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
合作探究
载体的选择
质粒、噬菌体、动、植物病毒等载体来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源 DNA片段的大小上也有很大差别。
思考下列基因的转入需要哪种载体？
1.计划让大肠杆菌表达人类激素？
2.计划让转基因羊的乳汁里含有人的凝血蛋白？
质粒、噬菌体
动物病毒
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
质粒
DNA分子
用EcoRⅠ限制酶切割
用EcoRⅠ限制酶切割
用DNA连接酶粘合
The basic tools of recombinant DNA technology
重组DNA技术的基本工具
思考讨论
载体的选择
请同学找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
The basic tools of recombinant DNA technology
重组DNA技术的基本工具
选择限制酶切割位点的基本原则
切割目的基因时：
切割质粒时：
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
DNA 的 粗 提 取 与 鉴 定
Rough extraction and identification of DNA
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
一、实验原理
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
观察左图，尝试描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
用高浓度的盐溶液（2mol/L的NaCl溶液）溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
用低浓度的盐溶液（0.14mol/L的NaCl溶液）使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。
取过滤液
取过滤物
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
2.DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质能溶于酒精。
3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
酶——蛋白酶
高温——大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，但DNA在
80℃以上才会变性
洗涤剂——能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响
4.DNA的鉴定
DNA+二苯胺 蓝色物质
沸水浴
对照组
实验组
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
二、实验设计
（一）实验材料的选取
那么应该选择什么样的材料呢？
思考：上述材料中哪些不能进行选择？为什么？
凡是含有DNA的生物材料都可，但是选用富含DNA的材料成功率会更高。
材料用具：
新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
（二）实验步骤
1.破碎细胞，获取DNA的滤液
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
研磨
注意事项：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶，研磨效果好（有利于充分研磨）；研磨不宜太用力
思考：若是动物细胞，该如何获取DNA滤液？
吸水涨破
2.去除滤液中的杂质
a.漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液；
b.也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
（核蛋白、脂质、多糖和RNA等杂质）
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
3.DNA的析出
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
4.DNA的鉴定
DNA滤液+同体积冷却的95%酒精
静置2~3min
白色絮状物
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
思考：为什么要沿一个方向搅拌？
丝状物或沉淀物+2mol/L的NaCl溶液5mL
二苯胺
加热
冷却后观察颜色变化
实验组
对照组
水浴加热
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
DNA的粗提取与鉴定
Rough extraction and identification of DNA
合作探究
1.为什么要提取出白色丝状物？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
鉴定结果呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶，以下说法正确的是 ( )
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特基因的DNA探针
A
3.图1为某种质粒结构简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是( )
A.在基因工程中若只用一种限制酶
完成对质粒和外源DNA的切割，则可选
EcoRⅠ
B.如果将一个外源DNA分子和一个
质粒分别用 EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoRⅠ酶切点有1个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理
D.质粒是一种结构很小的、能自主复制的环状DNA，是基因工程中最常用的载体
B