生物人教版（2019）选择性必修3 3.2基因工程的基本操作程序（共62张ppt）

(共62张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第三章 基因工程
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植
转基因抗虫棉。
到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药使用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
问题：
你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要那些步骤？
基因工程的基本操作流程
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
第一步
第二步
第三步
第四步
基因
具有遗传效应的DNA片段
DNA
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
终止子
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
编码区上游
编码区下游
真核基因
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区包括：编码区上游编码区下游
功能：不能编码蛋白质，
调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点，
转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：
外显子：
内含子：
能编码蛋白质的序列
不能编码蛋白质的序列
思考：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，
一定会产生原来的蛋白质吗？
成熟mRNA
相应酶去除内含子
转录
翻译
真核基因：编码区（外显子+内含子）
多肽链
前体mRNA
蛋白质
加工
提示：一般不能产生原来的蛋白质
原因：
①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
思考:如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，
如何产生与原来结构相同的蛋白质吗？
成熟mRNA
去除内含子
转录
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
相应酶
mRNA单链
提取
逆转录酶
DNA
单链
DNA双链
酶
这种双链DNA是不含内含子的DNA，叫做cDNA
提示：把真核基因的cDNA导入到原核细胞中表达。
基因工程的基本操作流程
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因（外源基因）
1、定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状
或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、
优良 品质、
生产药物、
毒物降解、
工业用酶、
等相关的基因。
目前广泛 使用的目的基因有：
植物抗病基因
人胰岛素基因
人干扰素基因
苏云金芽孢杆菌抗虫基因
目的基因的筛选
目的基因
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因
科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解
利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
目的基因的筛选
问题：明确了目的基因后，如何获取它呢？
目的基因的获取方法
1、从基因文库中直接获取
2、人工合成
3、利用PCR获取和扩增目的基因
1、从基因文库中直接获取
①基因文库的构建过程
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组文库:
部分基因文库:
包含一种生物的全部基因
（cDNA文库）
②基因文库类型：
包含一种生物的部分基因
目的基因的获取方法
（化学合成法、逆转录法）
2、人工合成
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
3、利用PCR获取和扩增目的基因
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，在生物体外，
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（2）原理： DNA半保留复制（体外）
复习：细胞内DNA复制
DNA在体内的半保留复制
条件：模板 、原料、能量、酶
模板：DNA的两条链（母链）
原料：四种游离的脱氧核苷酸
能量：一般由ATP
酶：解旋酶、DNA聚合酶
特点：半保留复制、边解旋边复制
复习：细胞内DNA复制
PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写
依据：DNA半保留复制的原理
是一项在体外对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
利用PCR获取和扩增目的基因
条件:缓冲液、DNA模板、4种脱氧核苷酸、
耐高温的DNA聚合酶、与两条模板链结合的2种引物
什么是引物？为什么需要引物？
引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。
DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸，
(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。
利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
引物
待扩增的DNA片段
3’
3’
变性
温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链
复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
利用PCR获取和扩增目的基因
3’
3’
3’
3’
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
总结：PCR过程
①变性（加热升温90℃以上）：双链DNA解旋，
在热作用下，氢键断裂，形成两条单链DNA。
②复性（退火降温50℃左右）：两种引物与两条DNA单链分别结合，形成模板-引物局部双链DNA。
③延伸（加热上升到72℃左右）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的子链。
利用PCR获取和扩增目的基因
用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，
经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，
其也可能随目的基因一起扩增。
PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
A
A
C
G
G
C
T
T
A
A
T
T
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
高温变性、低温复性
第
三次
循
环
3’
5’
中温延伸
第
三次
循
环
3’
5’
利用PCR获取和扩增目的基因
A
A
C
G
G
C
T
T
A
A
T
T
用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
3次
利用PCR获取和扩增目的基因
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA（目的基因）模板
4种脱氧核苷酸(dNTP)
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备
说明：dNTP（包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP），
dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。
dNTP既能为PCR提供原料,也能为形成磷酸二酯键提供能量。
利用PCR获取和扩增目的基因
1）引物是一小段，能 的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。
2）DNA复制时，子链是沿着5'端向3'端进行延伸，则引物与目的基因模板链的 端结合。
与DNA母链的一段碱基序列互补配对
3′
思考与讨论：
(3)利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________.
思考与讨论：
(4)设计两个与目的基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的____________________位点。
(5)设计两种引物的要求：______________________________________
限制性核酸内切酶
如何对PCR产物进行检测鉴定？
凝胶电泳
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，
用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
①引物自身不能环化
②两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
DNA混合物
－
＋
最长
最短
琼脂糖凝胶电泳
梳子
模具
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
1
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
2
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
3
点样孔
电泳槽
样品
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶1mm为宜。
4
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
5
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1 5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
6
取出凝胶，至于紫外灯下观察和照相。
7
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心）
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
1.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
目的基因
标记基因
启动子
终止子
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
启动子
（启动子≠起始密码）
终止子
（终止子≠终止密码）
一段有特殊序列的DNA片段，
位于基因的上游，
是RNA聚合酶识别和结合的部位，
驱动基因转录出mRNA。
一段有特殊序列的DNA片段，
位于基因的下游。
终止转录。
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
mRNA上三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA
决定转录
的结束
翻译的
起始信号
决定翻译过程的结束
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
目的基因
指外源DNA分子的有效片段
注意：目的基因必须插入到
启动子与终止子之间。
标记基因
用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，
从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
重组DNA分子
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
3.基因表达载体的构建过程
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
一般用同一种 酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用 酶把两者连接(如图)。
①单酶切
限制
DNA连接
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
①单酶切
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接
基因表达载体的构建（基因工程的核心）
②双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
将目的基因导入受体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、 转化：指目的基因进入受体细胞内，
并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。
将目的基因导入受体细胞
2. 受体细胞的选择：
①转基因植物用 ；
②转基因动物用 (一般不能用体细胞)；
原因是： 。
③微生物常用 等。微生物作为受体细胞的优点是 。
④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为 ，
原因是 ；
⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，
原因是 。
真核细胞
分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工
受精卵有发育的全能性
无核，无器，不能合成蛋白质
体细胞(叶、芽、根)或受精卵
受精卵
大肠杆菌、酵母菌
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
将目的基因导入受体细胞
3.转化的方法：
导入植物细胞
导入动物细胞
导入原核细胞
花粉管通道法、农杆菌转化法
显微注射法、病毒介导法
Ca2+处理法（感受态法）
将目的基因导入受体细胞
转基因植物
1.花粉管通道法（我国独创）
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
适用生物：开花植物
将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法
转基因植物
适用生物：双子叶植物
目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中
重组DNA转入杆菌
农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞
含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中
目的基因遗传特性稳定维持和表达
将目的基因导入受体细胞
农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，
而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T - DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。
转基因植物
将目的基因导入受体细胞
转基因动物
操作程序：
取受精卵
显微注射
胚胎移植
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
提纯基因表达载体
①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。
3.显微注射法（导入动物细胞）
将目的基因导入受体细胞
4、病毒介导法（主要用于导入动物细胞）
科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
转基因动物
将目的基因导入受体细胞
5.Ca2+转化法（导入微生物）
转基因微生物
使用Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（感受态细胞）
过程
微生物作为受体细胞有哪些优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
在抗虫棉的培育过程中，可以从哪些层次对目的基因进行检测与鉴定？
1.分子检测
2.个体水平鉴定
将目的基因导入受体细胞
1.分子检测
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
第二步 目的基因是否转录出mRNA
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质
PCR扩增
DNA分子杂交技术
PCR扩增
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
【拓展】基因探针
（1）定义：
（2）特点：
①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
将目的基因导入受体细胞
①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法1：PCR扩增
DNA半保留复制
原理：
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
2.提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
方法2：DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
将目的基因导入受体细胞
②.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA(cDNA)片段（基因探针），并用PCR扩增；
2.提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
将目的基因导入受体细胞
③.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
原理：抗原抗体的特异性结合
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原
转基因生物
将目的基因导入受体细胞
转Bt基因
非转基因
2.个体水平的检测
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
类型 检测内容 方法
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 或产物是否具有功能活性
抗虫、抗病的接种实验
产品功能活性比较
实例：如何鉴定转基因抗虫棉是否培育成功？
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐碱植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
一定浓度的盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
总结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：
（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是________________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______________。
（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是__________________________________，PCR定点突变技术属于________________的范畴.
（3）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用__________________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是__________________________。
DNA双链复制
耐高温的
DNA聚合酶（或Taq酶）
引物
能生产出自然界不存在的蛋白质
蛋白质空间结构较为复杂，改造困难
蛋白质工程
农杆菌转化法
植物细胞的全能性