生物人教版（2019）选择性必修3 3.1重组DNA技术的基本工具（课件共28张ppt）

(共28张PPT)
重组DNA技术的基本工具
第1节
一、基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋子生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
对基因工程概念的理解
基因工程的别名：
操作环境：
操作对象：
操作水平：
基本过程：
原理：
结果：
重组DNA技术、转基因技术
生物体外
基因
DNA 分子水平
剪切→拼接→导入→表达
基因重组
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
一、基因工程
来源：
种类：
主要来自原核生物
特点：
数千种
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
二、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
作用部位：
识别序列长度：
结 果：
特定切点上的磷酸二酯键
大多数是6个核苷酸序列
产生黏性末端或平末端
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯键
二、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
黏性末端
平末端
二、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
①能被限制性酶特异性识别的切割位点一般都具有回文序列：即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致。
②在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割，会产生4个末端。
注意：
二、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
作用：
三、DNA连接酶—“分子缝合针”
①E.coli DNA连接酶
种类：
②T4 DNA连接酶
从大肠杆菌分离得到
只能连接互补黏性末端的DNA片段
从T4噬菌体分离得到
黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
平末端
黏性末端
三、DNA连接酶—“分子缝合针”
磷酸二酯键
作用部位：
三、DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；
DNA连接酶连接的是DNA片段。
三、DNA连接酶—“分子缝合针”
总结归纳
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
三、DNA连接酶—“分子缝合针”
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
四、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
作用：
种类：
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒也可以。
四、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
运载体需具备的条件：
①能在受体细胞中稳定保存并复制
②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因
③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞
④对受体细胞无害、易分离
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
四、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
思考·讨论
四、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
四、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.实验原理：
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/LNaCl溶液。
提取原理
鉴定原理
五、DNA的粗提取与鉴定
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
3.材料用具：
①材料：新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
②用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
2.目的要求：
①了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
②学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
五、DNA的粗提取与鉴定
各试剂的作用：
①研磨液：
②体积分数为95%的酒精：
③2mol/L的NaCl溶液：
④二苯胺试剂：
⑤蒸馏水：
破坏细胞，释放出细胞内的物质
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L，从而析出DNA
五、DNA的粗提取与鉴定
研磨
①称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
过滤取上清液
②在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
4.过程：
五、DNA的粗提取与鉴定
析出DNA
③在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
五、DNA的粗提取与鉴定
DNA的鉴定
④取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
五、DNA的粗提取与鉴定
课堂练习
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
课堂练习
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
课堂练习
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
课堂练习
谢 谢 观 看