生物人教版（2019）选择性必修3 1.2.2微生物的选择培养和计数（课件共32张ppt）

(共32张PPT)
第1章 发酵工程
1.2.2微生物的选择培养和计数
1. 自然界中目的菌株筛选：
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
科学实例-寻找耐高温的DNA聚合酶
一.选择培养基
2.实验室中目的菌株的筛选：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止
其他微生物生长。
一.选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
3.选择培养基：
不加氮源
自养微生物
酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
固氮微生物
加入青霉素
加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
不加碳源
一.选择培养基
选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
疑难突破一：选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。
见P18页培养基配方
思考讨论
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
培养基二
①两种培养基中共有哪些成分？
疑难突破一：选择培养基配方的设计
思考讨论
碳源、氮源、无机盐、水
培养基一的碳源为_______，氮源为_______；
培养基二的碳源为_______，氮源为_______；
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
②从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？
培养基二属于选择培养基；其可获得能分解尿素的微生物。
当 堂 自 评
2.某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为CO2和NH3供植物吸收和利用,但分解物CO2不能为该菌提供营养。下列关于配制分离这一菌种的选择培养基的成分符合要求的是 (　　)
A.仅尿素 B.尿素+葡萄糖
C.仅葡萄糖 D.牛肉膏+蛋白胨
B
1.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　）
A. 较多的氮源物质 B. 较多的碳源物质
C. 青霉素类药物 D. 高浓度食盐
C
提出问题：土壤中有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？并研究1g土壤样品中含有多少这样的细菌？
实例：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、选择培养基的制备
2、对土壤样品进行稀释
3、稀释涂布平板法操作
4、微生物的培养与观察
阅读课本19页探究实践，总结实验流程：
原理：通过对土样进行充分稀释，再将菌液涂布到制备好的培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。
二.微生物的选择培养
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
②配方：
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
对照作用
思考1：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
①提供无机盐；
②调节pH。
1.选择培养基的制备
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
（1）土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
2.稀释土壤样品
（2）样品的稀释（梯度稀释菌液）
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
2.稀释土壤样品
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
【思考讨论】
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
问
微量
移液器
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。
3.稀释涂布平板法操作
①每个浓度至少设置4个平板
选择培养基（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征。
4.微生物的培养与观察
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
5. 鉴定培养基
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
常用微生物分离方法比较
二.微生物的选择培养
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面_________操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的_________，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
平板 示图
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
连续划线
梯度稀释
当 堂 自 评
3.下列属于平板划线法和稀释涂布平板法共同点的是 (　　)
A.都要使用接种环进行接种 B.可以用相同成分的培养基
C.都可以用来对活菌计数 D.都可以使用液体培养基
B
4.下列关于统计菌落数目的方法的叙述,正确的是 (　　)
A.采用平板划线法统计得到的样品菌落数往往多于实际的活菌数
B.当样品稀释度足够高时,一个活菌会形成一个菌落
C.为了保证结果准确,一般选用菌落密度较大的平板进行计数
D.采用平板划线法和稀释涂布平板法都可以对培养基中的菌落进行计数
B
[解析] 稀释涂布平板法不用接种环接种,A错误;
平板划线法和稀释涂布平板法可使用成分相同的固体培养基,B正确;
平板划线法一般用于分离微生物而不能用于计数,C错误;
平板划线法和稀释涂布平板法都是在固体培养基上进行接种的,D错误。
[解析] 平板划线法不能用于计数,用于计数的是稀释涂布平板法,A错误;
当样品的稀释度足够高时,一个活菌会形成一个单菌落,B正确;
为了保证结果准确,一般选取菌落数在30~300的平板进行计数,C错误;
稀释涂布平板法又称活菌计数,是由一个单细胞可繁殖成单个菌落这一培养特征设计的计数方法,可对微生物进行计数,而平板划线法不能用于计数,D错误。
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
三.微生物的数量测定
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
计数原则:
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
计算公式:
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
（234÷0.1）×106=2.34×109
答
B
例2：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
实例分析2：
某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1.甲同学____________________________________；
原因是____________________________________。
2.乙同学____________________________________；
原因是____________________________________。
实验操作不合理
未设置重复实验组
结果计算不合理
21与另外两组数值相差太大，应舍去
不能区分死菌与活菌；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.直接计数 —计数板计数法
①原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点：
（“染色排除法”）
微生物的计数方法比较
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M
　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
4.关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述,正确的是 (　　)
A.培养基应以尿素为唯一氮源,该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
B.对微生物进行分离、纯化用平板划线法,而稀释涂布平板法只能用于计数
C.对10 mL土样稀释106倍后,取0.1 mL该溶液进行重复的涂布实验,测得的菌落数分别为18、234、276,则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为2.55×108个
D.应该设置对照以排除非测试因素对实验结果的干扰,提高可信度
D
[解析] 从土壤中分离分解尿素的细菌时,培养基应以尿素为唯一氮源,尿素分解菌为异养型生物,利用的是有机碳源,硝化细菌是自养型生物,以二氧化碳为碳源,二氧化碳为无机物,A错误;
平板划线法只能用来分离、纯化微生物,不能用于计数,稀释涂布平板法既能计数活菌数目,又能用于分离纯化,B错误;
[(234+276)÷2]÷0.1×106×10=2.55×1010(个),C错误;
当 堂 自 评
6.[2021·重庆八中月考] 某兴趣小组在校园土壤中取样,进行“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验。小明从稀释倍数为106的培养基中筛选出约120个菌落,而其他同学只筛选出约40个菌落。下列有关叙述错误的是 (　　)
A.小明出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同
B.要证明培养基是否受到污染,可将小明配制的培养基不加土样进行培养
C.当稀释倍数太小时,可能由于菌落重叠而导致计数结果偏小
D.在牛肉膏蛋白胨培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌
D
[解析] 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,可初步鉴定尿素分解菌,
D错误。
当 堂 自 评
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
练习与应用
3.回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。硝化细菌在没有碳源的培养基上　　　　(填“能够”或“不能”)生长,原因是________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板　　　　(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是　　　　　　　　　　　　　　。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过　　　处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的pH不同
能够
硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
倒置
在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
灭菌
4. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
（2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
感谢观看！