生物人教版选择性必修3 3.1重组DNA技术的基本工具（共43张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版选择性必修3 3.1重组DNA技术的基本工具（共43张ppt） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 58.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-05-04 17:56:32 | ||
图片预览
文档简介
(共43张PPT)
第3章 基因工程
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
【归纳定义】工程别名：
操作对象：
操作水平：
工程实质：
什么是基因工程？
DNA重组技术
基因
DNA分子水平
基因重组
第1节
重组DNA技术的基本工具
三种“分子工具”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
来源：
种类：
主要来自原核生物
特点：
数千种
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
旁栏思考
1’
2’
3’
4’
5’
G
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
5'
3'
5'
3'
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
EcoRⅠ
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ
………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
黏性末端
黏性末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
EcoRI 限制酶的切割：
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
中轴线
SmaI 限制酶的作用：
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
在C和G之间切开
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
平末端 平末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
结果：
产生黏性末端或平末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
实践活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
5’...TAG
3’...ATCTTAA
AATTCCA...3’
GGT...5’
AATTC ...... B t ...... G
G .....基因......CTTAA
黏性
末端
目的基因
黏性
末端
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
会产生相同的黏性(平)末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
思考
【反馈练习】
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
2.下列是由同种限制酶切割形成的DNA片段是（ ）
①…CTGCA …
G
②…G
…CTTAA
③ G…
ACGTC…
④ AATTC…
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④C. ①④；②③ D.以上都不对
A
缺口怎么办？
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
什么样的末端才能连接起来？，
1. 作用：
2. 种类：
⑴ E·coli DNA连接酶
⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
3、DNA连接酶的缝合作用
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
（1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
（2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
3.E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型 来源
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
4.几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
3.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
5.基因工程技术也称为DNA重组技术,下列有关基因工程的说法错误的是 ( )
A.基因工程的基本原理是基因重组
B.基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
C.基因工程可以定向改造生物的性状
D.基因工程常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒
B
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
大肠杆菌及质粒结构模式图
3、运载体需具备的条件
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
（2）有一个至多个限制酶切点
（3）有某些标记基因
（4）对受体细胞无害、易分离
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于与不同目的基因结合
便于鉴定和筛选
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
5’................... pBI121 ................GAATTC........3’
3’................... 质 粒 ................CTTAAG........5’
实践活动二 、请将代表pBI121质粒的序列首尾黏贴在一起，模拟环化质粒
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
5’................... pBI121 ................GAATTC........3’
3’................... 质 粒 ................CTTAAG........5’
实践活动三、重组DNA分子的模拟操作
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
请用剪刀模拟EcoRI识别下面质粒序列和切割位点进行“切割”，将切下的片段与目的基因片段进行重组，并用透明胶条将切口粘连起来。
目的基因
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
思考 讨论
6.下列有关质粒的叙述中,正确的是 ( )
A.质粒是存在于细菌中的一种细胞器 B.质粒改造后可用作基因工程的载体
C.质粒上基因的表达不遵循中心法则 D.质粒必须具有抗生素抗性基因以便筛选
B
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
7．基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（ ）
A．能够复制，以便目的基因插入其中
B．具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
C
8.根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制性内切核酸酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有 和 。
(2)载体质粒用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:
为使载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,
还可用另一种限制性内切核酸酶切割,该酶必须具有的特点是
。
平末端
切割产生的DNA片段黏性末端与EcoRⅠ切割产生的相同
黏性末端
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即
DNA连接酶和 DNA连接酶。
(4)基因工程中除质粒外, 和 也可作为载体。
T4
噬菌体
动植物病毒
E.coli
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
材料用具
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
四、DNA的粗提取与鉴定
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
1.破碎细胞——
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
方法步骤
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
四、DNA的粗提取与鉴定
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
4.DNA的鉴定——
二苯胺
2mol/L的NaCl
方法步骤
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
四、DNA的粗提取与鉴定
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
思考与讨论：
如果是猪肝呢？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
四、DNA的粗提取与鉴定
1.一环状DNA分子,设其长度为1。限制性内切核酸酶A在其上的切点位于0.0处;限制性内切核酸酶B在其上的切点位于0.3处;限制性内切核酸酶C的切点未知。但C单独切或与A或B同时切的结果如下表,请确定C在该环形DNA分子的切点应位于图中的 ( )
A.0.2和0.4处 B.0.4和0.6处 C.0.5和0.7处 D.0.6和0.9处
A
C单切 长度为0.8和0.2的两个片段
C与A同时切 2个长度为0.2和1个0.6的片段
C与B同时切 2个长度为0.1和1个0.8的片段
课 堂 测 评
【能力提升】
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的
DNA片段相连接 为什么
XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
课 堂 测 评
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
3.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，________________________________________________________。
目的基因
质粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
【能力提升】
课 堂 测 评
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因与目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
谢谢观看!
第3章 基因工程
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
【归纳定义】工程别名：
操作对象：
操作水平：
工程实质：
什么是基因工程？
DNA重组技术
基因
DNA分子水平
基因重组
第1节
重组DNA技术的基本工具
三种“分子工具”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
来源：
种类：
主要来自原核生物
特点：
数千种
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
旁栏思考
1’
2’
3’
4’
5’
G
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
5'
3'
5'
3'
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
EcoRⅠ
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ
………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
黏性末端
黏性末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
EcoRI 限制酶的切割：
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
中轴线
SmaI 限制酶的作用：
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
在C和G之间切开
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
平末端 平末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
结果：
产生黏性末端或平末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
实践活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
5’...TAG
3’...ATCTTAA
AATTCCA...3’
GGT...5’
AATTC ...... B t ...... G
G .....基因......CTTAA
黏性
末端
目的基因
黏性
末端
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
会产生相同的黏性(平)末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
思考
【反馈练习】
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
2.下列是由同种限制酶切割形成的DNA片段是（ ）
①…CTGCA …
G
②…G
…CTTAA
③ G…
ACGTC…
④ AATTC…
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④C. ①④；②③ D.以上都不对
A
缺口怎么办？
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
什么样的末端才能连接起来？，
1. 作用：
2. 种类：
⑴ E·coli DNA连接酶
⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
3、DNA连接酶的缝合作用
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
（1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
（2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
3.E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型 来源
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
4.几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
3.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
5.基因工程技术也称为DNA重组技术,下列有关基因工程的说法错误的是 ( )
A.基因工程的基本原理是基因重组
B.基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
C.基因工程可以定向改造生物的性状
D.基因工程常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒
B
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
大肠杆菌及质粒结构模式图
3、运载体需具备的条件
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
（2）有一个至多个限制酶切点
（3）有某些标记基因
（4）对受体细胞无害、易分离
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于与不同目的基因结合
便于鉴定和筛选
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
5’................... pBI121 ................GAATTC........3’
3’................... 质 粒 ................CTTAAG........5’
实践活动二 、请将代表pBI121质粒的序列首尾黏贴在一起，模拟环化质粒
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
5’................... pBI121 ................GAATTC........3’
3’................... 质 粒 ................CTTAAG........5’
实践活动三、重组DNA分子的模拟操作
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
请用剪刀模拟EcoRI识别下面质粒序列和切割位点进行“切割”，将切下的片段与目的基因片段进行重组，并用透明胶条将切口粘连起来。
目的基因
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
思考 讨论
6.下列有关质粒的叙述中,正确的是 ( )
A.质粒是存在于细菌中的一种细胞器 B.质粒改造后可用作基因工程的载体
C.质粒上基因的表达不遵循中心法则 D.质粒必须具有抗生素抗性基因以便筛选
B
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
7．基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（ ）
A．能够复制，以便目的基因插入其中
B．具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
C
8.根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制性内切核酸酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有 和 。
(2)载体质粒用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:
为使载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,
还可用另一种限制性内切核酸酶切割,该酶必须具有的特点是
。
平末端
切割产生的DNA片段黏性末端与EcoRⅠ切割产生的相同
黏性末端
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即
DNA连接酶和 DNA连接酶。
(4)基因工程中除质粒外, 和 也可作为载体。
T4
噬菌体
动植物病毒
E.coli
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
材料用具
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
四、DNA的粗提取与鉴定
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
1.破碎细胞——
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
方法步骤
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
四、DNA的粗提取与鉴定
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
4.DNA的鉴定——
二苯胺
2mol/L的NaCl
方法步骤
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
四、DNA的粗提取与鉴定
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
思考与讨论：
如果是猪肝呢？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
四、DNA的粗提取与鉴定
1.一环状DNA分子,设其长度为1。限制性内切核酸酶A在其上的切点位于0.0处;限制性内切核酸酶B在其上的切点位于0.3处;限制性内切核酸酶C的切点未知。但C单独切或与A或B同时切的结果如下表,请确定C在该环形DNA分子的切点应位于图中的 ( )
A.0.2和0.4处 B.0.4和0.6处 C.0.5和0.7处 D.0.6和0.9处
A
C单切 长度为0.8和0.2的两个片段
C与A同时切 2个长度为0.2和1个0.6的片段
C与B同时切 2个长度为0.1和1个0.8的片段
课 堂 测 评
【能力提升】
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的
DNA片段相连接 为什么
XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
课 堂 测 评
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
3.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，________________________________________________________。
目的基因
质粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
【能力提升】
课 堂 测 评
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因与目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
谢谢观看!