(共56张PPT)
第四章 生物化学与分子生物学技术实践
第四章 生物化学与分子生物学技术实践
第一节 生物成分的分离与测定技术
学习导航
1.尝试蛋白质的提取和分离。(重点)
2．理解蛋白质分离与纯化的原理。(重难点)
3．研究从生物材料中提取某些特定成分。(重点)
4．尝试测定生物材料中某些化学物质的含量。(难点)
新知初探 思维启动
提取步骤 提取方法
分离生物组织 机械破碎
破碎细胞 __________、超声波法、
酶解法等
抽提：根据蛋白质的不同特性，选择不同溶剂进行抽提，使蛋白质呈溶解状态释放出来 酸性蛋白质：用______________抽提
水溶性蛋白质：用_________ (中性缓冲液)抽提
脂溶性蛋白质：用___________抽提
研磨法
稀碱性溶液
透析液
有机溶剂
2.纯化
(1)原理：蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度、_________________、吸附性质等方面存在差异。
(2)方法
①透析法：利用蛋白质分子不能透过_________
的特性使蛋白质与_____________________分离开来。
所带电荷的多少
半透膜
其他小分子化合物
②离心沉降法：通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。
③电泳法
a．含义：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象；
b．原理：不同物质在同一电场中的__________不同；
泳动速度
c．泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球
形，所带净电荷_______，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。
越多
1．(1)常用吸水涨破的方法释放哺乳动物成熟的红细胞中的蛋白质。(√)
(2)通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质。(×)
(3)电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电性相同的电极移动的现象。(×)
判一判
二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作
1.原理
血清蛋白包含一组蛋白质，其大小、形状、所带净电荷各不相同，在电场作用下会发生__________。
2.操作流程
配制试剂→__________→浸泡薄膜→细心点样→__________→实施电泳→_________→漂洗→脱色。
电泳
架滤纸桥
平悬薄膜
染色
3.实验结果分析
呈现5条蛋白质色素带，从点样处一侧开始，依次是：γ-球蛋白、___________蛋白、α2-球蛋白、α1-球蛋白和__________。
β-球
清蛋白
人们常说的血清蛋白是一种蛋白质吗？说说你了解的情况。
提示：不是一种蛋白质，而是包含多种蛋白质：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
想一想
三、从生物材料中提取某些特定成分
芳香油特点：具有__________，能与水蒸气一起蒸发，易溶于___________，如石油醚、乙醚或________等。
橘皮芳香油的特点：橘皮芳香油存在于
_______________中，具有一定的________，其沸点________水的沸点。
植物芳香油提取方法：蒸馏、________等。
挥发性
有机溶剂
酒精
果皮的油细胞
挥发性
低于
萃取
2．(1)水蒸气蒸馏法的基本原理是植物芳香油易溶于水。(×)
(2)蒸馏装置中进水口在上方，出水口在下方。(×)
(3)橘皮油可以通过机械加压、压榨出果皮中的芳香油进行提取。(√)
判一判
要点突破 讲练互动
电泳法、影响电泳泳动速度的因素、注意事项及容易产生的几种现象
1.电泳法：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。支持物电泳是目前纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。
支持物可以是滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。采用醋酸纤维薄膜作为支持物具有方法简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰等优点，广泛应用于科学实验、临床化验和生化产品的分析(血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离与鉴定)等方面。
几点说明：
(1)膜的预处理：必须于电泳前将薄膜浸泡于缓冲液中，浸透后，取出薄膜并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。
(2)加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白的常规电泳分析，每厘米加样线不超过2～3 μL，相当于60～80 μg的蛋白质。
(3)电泳：可在室温下进行。电压为25 V/cm，电流为0.4～0.8 mA/cm。
(4)染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春
红，血浆蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸?Schiff试
剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。
(5)脱色与透明：对水溶性染料应用最普遍的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸∶无水乙醇＝3∶7的透明液中。
特别提醒
第一步中缓冲液要用容量瓶准确配制，试剂要多配一些备用。第二步中要驱除气泡，贴紧贴
实，避免影响电泳速度和分离效果。第三、四步中作有记号的醋酸纤维薄膜光泽面朝下。第七步中染色时间要适中(5～10 min)，不宜过长或过短。第八步中漂洗要彻底，防止遮盖蛋白质色带颜色。
2.响电泳泳动速度的因素
影响电泳泳动速度的因素很多，其中主要因素有带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少；此外，还有电场强度、溶液的pH等因素。
3.注意事项
(1)保持醋酸纤维薄膜的清洁，避免用手直接接触薄膜。
(2)点样要适量，2次左右即可，盖玻片的边缘应避免出现明显液滴，点样要尽量在一条直线上。
(3)电泳时间不低于1 h。
(4)点样处不要搭在滤纸上，以免血清渗入滤
纸。
(5)醋酸纤维薄膜应绷直，避免电泳槽隔离板的干扰。
(6)不可同时接触正负极，防止触电。
4.容易产生的几种现象
(1)电泳图谱不齐：点样时血清滴加不匀。
(2)电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或由于电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水分蒸发干燥造成的。
(3)分离不良：样品滴加过多。
(4)区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05。
(5)区带过于紧密：缓冲液离子强度大于0.075。
(6)染色后清蛋白中间色浅：染色时间不足，或清蛋白含量过高，此时可减少检样用量或延长染色时
间。
(7)球蛋白向反方向移动：系电渗现象，可升高点样端缓冲液液面高度，或适当加大电流量克服之。
(8)透明时若膜不干或透明液中醋酸含量不足，可造成膜发白，不能完全透明；若透明液中醋酸含量过
高，或室温过高，可使膜溶解，此时可酌情减少醋酸含量。
(2012·南京高二检测)仔细观察下图，所带负电荷少的球蛋白是( )
例1
A．α1-球蛋白 B．α2-球蛋白
C．β-球蛋白 D．γ-球蛋白
【解析】 对于几种球蛋白来说直径相差不
大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且γ-球蛋白距点样处最近，所以γ-球蛋白所带负电荷最少。
【答案】 D
【探规寻律】 必须清楚泳动速度的差异主要取决于电荷的多少。所带净电荷越多，则在电场中泳动的速度越快，反之则越慢。
1.有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pH分别为4.5、5.2、6.6、7.2，电泳时欲使其中三种泳向正极，缓冲液的pH应该是( )
A．2.0 B．5.0
C．6.0 D．7.0
解析：选D。在缓冲液的pH为7.0的溶液中，pH分别为4.5、5.2、6.6的蛋白质均带负电荷，在电泳时移向正极。
变式训练
比较水蒸气蒸馏、压榨法和有机溶剂萃取的异同点
实验原理 方法步骤 适用范围
水蒸气蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来 ①水蒸气蒸馏
②分离油层
③除水过滤 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
实验原理 方法步骤 适用范围
压榨法 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 ①石灰水浸泡、漂洗
②压榨、过滤静置
③再次过滤 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取
有机溶剂萃取 使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂后就可获得芳香油 ①粉碎、干燥
②萃取、过滤
③浓缩 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中
特别提醒
在用萃取法提取芳香油时，由于要将有机溶剂从萃取液中蒸发出去，故萃取剂的沸点要比所要提取芳香油的沸点低。
在蒸馏过程中，要提高产品质量，应该采取的措施是( )
A．提高蒸馏温度，延长蒸馏时间
B．提高蒸馏温度，缩短蒸馏时间
C．降低蒸馏温度，缩短蒸馏时间
D．严控蒸馏温度，延长蒸馏时间
例2
【思路点拨】 解答本题可以从两个角度分析：
①温度过高会破坏蒸馏提取物的有效成分。
②时间过短会使有效成分得不到有效提取。
【解析】 用蒸馏法分离植物有效成分时，温度会影响其性质，如果温度过高则破坏其结构，温度过低则分离不出其有效成分。如果在一定温度范围内延长蒸馏时间，就可以得到较多的植物有效成分。
【答案】 D
互动探究
在水蒸气蒸馏装置中，为什么要让冷水由冷凝管的下方流入，上方流出？
【提示】 这样可以冷却得更充分。
从植物材料中提取某些特定成分
1.蒸馏法：植物芳香油提取的常用方法
蒸馏法的类型 水中蒸馏 水上蒸馏 水气蒸馏
特点 原料放在蒸馏容器的水中，水要完全浸没 容器中水的上方有筛板，水量以沸腾时不浸润原料为宜 蒸馏容器下方有一个通气孔，连接外源蒸气，上方有筛板，上面放有原料
(1)水蒸气蒸馏装置的安装顺序和方法
如上图所示，整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸
馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接
收。安装仪器一般都按照自下而上、自左到右的顺序，拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下：
①固定热源——酒精灯。
②固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如上图中所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。
③安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。
④连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。
⑤连接接液管(或称尾接管)。
⑥将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接收瓶，接收瓶应在实验前称重，并作好记录。
⑦将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。
2.萃取法
(1)原理：植物芳香油可以溶于有机溶剂(石油醚、酒精、乙醚、戊烷等)中，对于不适于蒸馏的原料可以采用萃取法。大致方法是将干燥的植物粉碎，用有机溶剂浸泡后，芳香油就会溶解在溶剂中，然后蒸发掉有机溶剂就可以获得植物芳香油了。
玫瑰精油提取的过程是( )
A．鲜玫瑰花＋水→水蒸气蒸馏→油水混合物→分离油层→除水
B．鲜玫瑰花＋水→油水混合物→水蒸气蒸馏→分离油层→除水
C．鲜玫瑰花＋水→油水混合物→除水→分离油层
D．鲜玫瑰花＋水→油水混合物→水蒸气蒸馏→分离油层→除水
例3
【解析】 玫瑰精油提取的一般流程是将鲜玫瑰花和清水先按1∶4的质量比混合，然后利用水蒸气蒸馏法获得油水混合物，再加入NaCl，分离油层，进而加入无水Na2SO4，将油层中的水进一步除去，最后过滤获得玫瑰精油。
【答案】 A
变式训练
2.用蒸馏法提取玫瑰精油的有关叙述错误的是( )
A．蒸馏温度高，水和玫瑰精油挥发得就容
易，所以在高温下蒸馏效果好一些
B．为了充分蒸馏玫瑰精油，应该在较低温度下延长蒸馏时间
C．在乳浊液分层的时候，为了利于水和油层的分开，向乳化液中加入氯化钠
D．水和油层分开后，应在初提取的玫瑰精油中加入适量的无水硫酸钠吸去残留的水分，放置过夜，经过滤除去固体硫酸钠后，就可以得到玫瑰精油
解析：选A。蒸馏温度太高、时间太短，玫瑰精油的品质就比较差，如果要提高品质，就需要在较低温度下延长蒸馏时间。
向乳浊液中加入氯化钠，增加盐的浓度，有利于水和油分层，通过分液漏斗排去水，得到粗提取的玫瑰精油，再加入适量的无水硫酸钠吸去残留的水分，放置过夜，过滤除去固体硫酸钠后，就可以得到玫瑰精油。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
实验步骤 操作方法
①配制试剂 配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液
②架滤纸桥 取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于支架上
实验步骤 操作方法
③浸泡薄膜 用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡20 min
④细心点样 取出薄膜，吸去多余液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下，点样时用盖玻片在血清中蘸一下，在离薄膜一端2～3 cm处轻轻按下，随即提起
⑤平悬薄膜 将点样端平贴在电泳槽负极支架的“滤纸桥”上，有记号的一面朝上，另一端平贴于正极，呈绷直状态
实验步骤 操作方法
⑥实施电泳 盖上电泳槽盖，电泳60～90 min
⑦染色 取下薄膜，放入染色液中浸泡5～10 min
⑧漂洗 取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净为止
⑨脱色 用滤纸压平并吸干薄膜，再浸入透明液中约5 min，取出后平贴于玻璃板上，待完全干燥后便成透明膜
【结果及分析】
1.区带不分离，没有出现理论上的5条带。
原因：电泳时间不够，电压偏低，点样量过多。
2.区带不清晰，颜色很浅。
原因：点样量不够。
3.区带不平行，弯曲、间断。
原因：点样时未点在一条直线上，醋酸纤维薄膜上的醋酸纤维素粉涂布不均匀。
【问题与探究】
1.漂洗液与透明液的区别是什么？
【提示】 从功能上看，漂洗液用来洗脱背景颜色，而透明液用来脱水固定(使显色后的区带长久保存)；从成分上看，透明液中乙醇含量70%(V/V)，远高于漂洗液，脱水效果明显。
2.为什么要盖上盖子进行电泳？
【提示】 为了使电泳槽内维持饱和蒸汽压，以免醋酸纤维薄膜在电泳过程中因电流通过发热而变干。
【例题】 某蛋白质等电点为7.5，在pH为6.0的缓冲液中进行自由界面电泳，其泳动方向为( )
A．向负极移动
B．向正极移动
C．不运动
D．同时向正极和负极移动
【解析】 在pH＝6.0的缓冲液中蛋白质带正电荷，其泳动方向为向负极移动。
【答案】 A(共71张PPT)
(二) 无菌操作和接种技术及微生物的分离、培养与数量测定
学习导航
1.学会无菌操作和接种技术。(重点)
2．研究培养基对微生物的选择作用。(重点)
3．了解平板分离微生物的方法和计数。(重点)
4．简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。(难点)
新知初探 思维启动
无菌
培养基
玻璃刮铲
穿刺
平板划线
2.无菌操作——微生物接种技术的关键
(1)培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要_________。
(2)通常接种操作要在_______________的附近进行。
灭菌
酒精灯火焰
1．在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作？
提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。
想一想
二、微生物的分离
1.原理：根据微生物对___________、氧气、pH等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的_______条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到_____________微生物的目的。
2.方法
(1)据菌落形态特征初步分离
营养成分
必需
选择分离
①菌落：________微生物在适宜的______培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、有一定__________的子细胞生长群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，称为________。
②菌落特征：不同微生物在________培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该类微生物进行______、_______的重要依据。
单个
固体
形态结构
菌苔
特定
分类
鉴定
涂抹平板法
平板划线法
单个
(1)使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不再灭菌。(×)
(2)富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，反之则多。(×)
(3)菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。(√)
(4)稀释涂抹平板法的结果都可在培养基表面形成单个的菌落。(×)
判一判
三、土壤微生物的分离和计数
1.准备实验器材
2.采集土壤，制备悬液
(1)制备悬液
称取0.5 g土壤样品，倒入盛有50 mL无菌水的锥形瓶，振荡20 min，使土样充分打散，即成为10－2 g/mL的土壤悬液。
(2)等比稀释
用无菌移液管吸取0.5 mL土壤悬液注入盛有4.5 mL_________的1号试管，配成10－3 g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号试管3次，使悬液均匀，再吸取0.5 mL注入盛有4.5 mL无菌水的2号试管，配成10－4 g/mL的土壤悬液。以此类推，依次配制成10－5 g/mL、10－6 g/mL、10－7 g/mL、10－8 g/mL的土壤悬液。
无菌水
3.选择适于分离特定微生物的培养基
不同微生物的代谢特性不同，通过
____________可选出所需要的特定微生物。
4.接种
采用3支无菌移液管分别吸取10－8 g/mL、10－7 g/mL、10－6 g/mL的土壤悬液各1 mL加入培养皿中，每个浓度设置_____个重复，并充分振荡混合均匀，用______平板法进行分离。
选择培养基
3
涂抹
5.培养与观察
将培养皿倒置于________ ℃恒温箱中培养1～
2 d，观察细菌菌落。
6.计数菌落
培养24～48 h后取出平板计数，选取菌落数为30～300的一组为代表进行统计。
每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(假定涂抹所用稀释液为1 mL)。
37
2．A同学分离与培养土壤微生物时与其他同学的结果相差很大，请分析可能的原因是什
么？并进一步通过对照实验验证原因。
想一想
可能原因 实验验证 结论
所取土样不同 其他同学用与A同学一样的土样进行实验 若结果与A同学的一致，则说明土样没问题；若结果与A同学的不一致，则说明A同学操作失误或培养基配制有问题
培养基污染或操作失误 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作空白对照 若有菌落出现，则说明培养基被污染，若无菌落出现，则说明未被污染
提示：
四、设计实验分离土壤中能分解纤维素的微生物
1.研究目的
从土壤微生物中筛选出能分解纤维素的微生物。
2.实验原理
纤维素分解菌可以分泌____________，在用
__________作为惟一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，其他微生物则不能生长。
纤维素酶
纤维素
3.方法步骤
(1)制备选择培养基：培养基中提供碳源的物质只有____________。
(2)分装
(3)制备土壤稀释液：依次制备稀释度为10－1、10－2、10－3、10－4、10－5的土壤稀释液。
纤维素
(4)接种培养：分别吸取各稀释度的土壤稀释液1 mL接种到滤纸条上，每个稀释度重复4次，置__________中培养。
(5)观察：检查各试管中滤纸条上出现的______和滤纸颜色的变化情况。
培养箱
菌落
3．在等比稀释的过程中如何使微生物在菌液中均匀分布？你认为计数的菌落与实际菌落之间存在什么样的关系？
提示：每次吸取前都要将土壤悬液充分振荡混合均匀。实际菌落数目大于计数的菌落数目。
想一想
要点突破 讲练互动
无菌操作
1.无菌技术的概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。
2.无菌技术的具体内容
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
(4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。
特别提醒
在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌锅、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A．接种环、手、培养基
B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环
D．接种环、手、高压锅
例1
【解析】 此题考查学生对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
【答案】 C
1.下列操作错误的是( )
A．用酒精擦拭双手
B．用氯气消毒水源
C．实验室用紫外线进行消毒
D．玻璃器皿(吸管、培养皿)用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的
变式训练
解析：选D。玻璃器皿、金属用具等耐高温、需要保持干燥的物品，应采用干热灭菌法进行灭菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底灭菌的目的。
1．原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落。
平板分离法
2.常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。
3.方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生
长。
(2)混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化的琼脂混合，将与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。
(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。
4.目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的微生物的单个菌落。
(1)灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。
(2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。
(2012·盐城高二检测)下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1→2→3→4→5。下列操作方法正确的是
( )
A．操作前要将接种环放在火焰旁边灼烧灭菌
B．划线操作要在火焰上进行
C．在5区域中才可以得到所需菌落
D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
例2
【解析】 操作前要将接种环放在酒精灯的外焰灼烧进行灭菌；整个操作过程要在酒精灯旁进行；1、2、3、4、5这五个区域都可能有所需菌落；在每次画线前对接种环灼烧是为了杀死上次画线结束后接种环上残留的菌种，画线结束后对接种环灭菌是为了杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
【答案】 D
变式训练
2.有关稀释涂抹平板法的叙述，错误的是
( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面
C．适宜条件下培养
D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落
解析：选D。稀释涂抹平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
菌落数目的统计方法
1.显微镜直接计数法
(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
(2)方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻
片，其上有特定的面积为1 mm2，高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中
格，每个中格再被划分成16个(或25个)小格，每个计数室都由400个小格组成。
(3)操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
(4)计算公式
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。
(5)缺点：不能区分死菌与活菌。
2.间接计数法(活菌计数法)
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落
数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培
养，计算出菌落平均数。
②为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
3.滤膜法
(1)实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。
(2)过程：将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红?美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
特别提醒
统计菌落数目的注意事项：
①一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
③统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。
④设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
例3
【思路点拨】 本题主要考查统计菌落数目的方法，解答本题需从以下几点入手：
①区分实验材料的灭菌方法。
②理解空白对照在菌落计数实验中的作用。
③明确菌落计数的选择范围。
【解析】 本题考查的是土壤微生物总数的计数，所以培养所使用的培养基就应该是基本培养基，并要经过高压蒸汽灭菌处理；涂布时要对样本的水溶液进行稀释，一般选取104、105、106倍的土壤稀释液各0.1 mL进行涂布，为了检查平板培养基是否制备合格，要同时把一培养基接种少量无菌水，以作空白对照；
培养一段时间后，如果平板上菌落个数在30～300之间，即可把该组所有平板的菌落计数，然后取其平均值，即可计算出土壤细菌的总数。而D项是菌落数在300以上，故D项错。
【答案】 D
互动探究
C项倒置平板的目的是什么？
【提示】 防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成培养基污染。
【探规寻律】 每一稀释度下设置多于3个平板，一般选择菌落数在30～300之间的平板计数。若几个平板的菌落数均不在30～300之间，但几个平板菌落数目相近，且接近30～300之间(如菌落数目为28、25、24、27)，则也可以取其平均值作为菌落数。
变式训练
3. (2012·安康高二检测)自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
步骤如下：
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果，应选用________法接种样品。
③适宜温度下培养。
结果分析：
(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是( )
A．一个平板，统计的菌落数是23
B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24
C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和
52，取平均值26
D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25
(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每升样品中的菌落数是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)____________。
(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________(多、少)，因为_____________________________________________________________________________________________________________________。
解析：若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂抹平板法接种样品。实验时，每一个浓度至少涂布三个平板，以增强实验的说服力和准确性。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)23.4÷0.2×106＝1.17×108。(3)因为菌落可能由1个或多个大肠杆菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
答案：步骤②：稀释涂抹平板 (1)D (2)1.17×108
(3)多 当两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上观察的是一个菌落
实验探究 专项突破
【操作与实践】
微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。
微生物的分离
1.稀释
用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，依次类推制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。
2.划线或涂布
(1)平板划线分离法——在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种(如图)。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。
特别提醒
平板划线法中的注意事项
①取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
取菌种之前 每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(2)涂布分离法——取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5和10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌液吸附进培养基(如图)。
特别提醒
①将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。
②操作中一定要注意防火，不要将过热的玻璃刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
3.培养
将划线或涂布接种的平板倒置于37 ℃培养箱
中，培养16～24 h，即可长出单菌落。
【问题与探究】
1.在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？
【提示】 (1)酒精灯与培养皿的距离要适中。
(2)接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。
(3)接种环要用酒精灯灼烧。
(4)将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。
2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？
【提示】 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要重新制备。
3.在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立菌落？
【提示】 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上出现其他菌落，有其他杂菌混杂，可再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
【例题】 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题：
(1)培养基中加入的化合物A是________，为微生物的生长提供________，这种培养基从功能上进行分类，应属于________培养基。
(2)若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答：
①在接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
__________________________________。
②在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
___________________________________。
③除此之外，还可用____法来获得纯净的菌株。
【解析】 若筛选到能利用纤维素(可产生纤维素酶)的微生物，培养基中加入的化合物A，应为纤维素。制备只以纤维素作碳源的选择培养基，能在该培养基中生长的微生物应为可产生纤维素酶的微生物，此即目标微生物。
【答案】 (1)纤维素 碳源 选择
(2)①第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落
②划线结束后仍要灼烧接种环，以免菌种对环境造成污染
③稀释涂抹平板(共67张PPT)
第三章 酶的应用技术实践
第三章 酶的应用技术实践
第一节 酶的制备和应用
学习导航
1.理解酶及酶活力的概念，简述酶活力测定的一般原理和方法。
2．尝试利用苹果匀浆制成果汁的最佳条件的实验，测定果胶酶的活性并观察果胶酶对果汁
形成的作用。(重点)
3．了解洗涤剂中的酶制剂，探讨洗衣粉中的酶制剂在洗涤中的作用。(重点)
4．学习对照性实验及探究实验的设计思想。(难点)
新知初探 思维启动
酶活性
酶促反应的速率
减少量
生成量
2.影响酶活力的因素
生物体内具有_______功能的蛋白质称为酶，酶分子易受一些物理因素(如热、紫外线等)和化学因素(如酸、碱、有机溶剂等)的作用而变
性，从而丧失活力。因此，酶活力的高低会受______、___、激活剂等多种因素的影响。
催化
温度
pH
1．(1)生物体内的蛋白质均具有催化功能。(×)
(2)在适宜的条件下，酶的活性最高。(√)
(3)低温和高温均会破坏酶的结构，使酶丧失活性。(×)
判一判
二、果胶及果胶酶的制备
1.果胶
(1)分布
广泛存在于______________特别是水果和蔬菜的组织中。
(2)作用
在植物细胞或组织间起黏合作用，是植物
____________和___________的重要成分。
高等植物
细胞间质
细胞壁
(3)性质
溶于水形成__________液体。
2.果胶酶制备
50 g新鲜水果或蔬菜，在______的研钵内迅速剪碎后研磨，同时加入_______________________溶液50 mL制成匀浆液，漏斗中放置滤纸或
__________过滤收集滤液，以4000 r/min的离心速率离心滤液15 min收集上清液，用0.1 mol/L冰醋酸调pH至3～4，在0～4 ℃下保存备用。
黏稠状
预冷
质量分数为10%的NaCl
5层纱布
2．(1)植物细胞壁主要是由纤维素和果胶构成
的。(√)
(2)果胶酶主要存在于离心管的下层沉淀中。(×)
(3)提取果胶酶一般是在低温、偏碱性的提取液中进行。(×)
判一判
三、洗涤剂中常见的酶制剂
1.化学洗涤剂
(1)分类：按产品的外观形态可分为肥皂、合成洗衣粉和液体洗涤剂等多种类型。
(2)去污原理：去污能力主要来自
______________，因为表面活性剂有降低表面张力的作用，可以渗入到_____________中把污垢挤出来。
表面活性剂
纤维空隙
2.洗涤剂中常用酶制剂的种类及洗涤原理和实例
种类 洗涤原理 洗涤实例
蛋白酶 可将蛋白质水解为可溶性的________ 可除去血渍、奶渍及各种食品类的________污垢
脂肪酶 把脂肪水解为较易溶解的______和游离的_________ 可除去食品的油渍、人体皮脂、口红等污垢
多肽
蛋白质
甘油
脂肪酸
种类 洗涤原理 洗涤实例
淀粉酶 能使淀粉迅速水解为
__________、糊精等 可除去面条、巧克力、土豆泥、粥等污垢
纤维素酶 使纤维的结构变得
_______，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗涤剂充分接触，达到更好的去污效果 可除去棉纺织品表面的浮毛
麦芽糖
蓬松
一般加酶洗衣粉外包装上印有以下说明：注意切勿用于丝质及羊毛衣料，用后须彻底清洗双手。为什么外包装上要注明这些问题？
提示：通常加酶洗衣粉中含有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等制剂，可分解蛋白质类、脂肪类、淀粉类等污垢。丝质、羊毛衣料及人的双手皮肤的成分主要是蛋白质，如果用加酶洗衣粉，其中的蛋白酶可将蛋白质分解成多肽，这样对衣料和人的双手有损坏作用。
想一想
要点突破 讲练互动
影响酶活力的因素
1.温度
酶活力随温度的变化而变化的趋势可用图示表示：
(1)温度从t1到t时，随着温度的升高，酶活力逐渐增强。
(2)温度从t到t2时，随着温度的升高，酶活力逐渐降低。
(3)温度高于t2时，酶活力全部丧失。
(4)t3、t4条件下，酶活力相同。
(5)t为最适温度，即在该温度时，酶的活力最
强。
2. pH
每种酶都有一定的最适pH范围。例如，果胶酶最适pH范围为3～4。过酸、过碱都会使酶发生不可逆失活。
3.酶的激活剂
有时加入酶的激活剂可以提高酶活力。例如，NaCl可以提高果胶酶的活力。
4.酶的抑制剂
加入酶的抑制剂后可以降低酶活力，甚至使酶失去活力。例如，Fe3＋、Ca2＋、Zn2＋等重金属离子对果胶酶有抑制作用。
特别提醒
酶活力的高低受温度、pH、激活剂等多种因素的影响，所以酶的提取一般选择在低温和适合的pH下进行，有时还要加入酶的激活剂以提高酶活力。
(2012·南京高二质检)有些酶必需在有激活剂的条件下才具有活性。下列是有关某种酶的实验，处理方式及结果如下表及下图所示。根据结果判断，叙述不正确的是( )
例1
试管编号 试管Ⅰ 试管Ⅱ 试管Ⅲ
pH 8 8 7
温度 80 ℃ 40 ℃ 40 ℃
酶 1 mL 1 mL 1 mL
底物 1 mL 1 mL 1 mL
A．甲物质是该酶的激活剂
B．该酶在80 ℃的环境条件下没有活性
C．试管Ⅲ中酶的活性比试管Ⅱ中的高
D．35 min后试管Ⅱ中产物的量不再增加
【思路点拨】 本题主要考查影响酶活性的因素及对实验结果的分析处理。解题的关键
是：
①分析各试管的条件。
②曲线图表示的实验结果的含义，底物的减少意味着反应的进行。
【解析】 加入物质甲后，试管Ⅱ、Ⅲ反应明显加快，说明甲物质是该酶的激活剂；试管Ⅰ与试管Ⅱ温度不同，其他条件相同，实验结果试管Ⅰ底物无反应，说明该酶在80 ℃的环境条件下没有活性，曲线图中35 min后试管Ⅱ中底物含量为
0，完全反应了，则产物的量不再增加，A、B、D正确。试管Ⅲ比试管Ⅱ底物减少得慢，说明试管Ⅲ中酶的活性比试管Ⅱ中的低。
【答案】 C
1.酶制剂已经广泛地应用于工业、医药等方面，在生产中使用酶制剂时，需要进行酶活性的测
定，而适宜的温度是酶活性的保证。如图四条曲线分别表示在四种不同温度下反应物消耗量随时间的变化。则该酶作用的适宜温度应处于哪一种温度附近( )
变式训练
A．T1 B．T2
C．T3 D．T4
解析：选A。本题考查酶活性曲线分析。酶在适宜的温度时化学反应能较快地进行，反应物消耗速率快。
果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中，通常动物细胞不能合成这类酶。
1.果胶酶在食品工业中的主要应用
(1)水果中的果胶经果胶酶水解后，可降低果汁的黏度，有助于压榨并提高出汁率。
果胶酶的相关知识
(2)在进行果汁沉降和离心时，能破坏果汁中悬浮物的稳定性，使其凝聚沉淀，得到澄清果汁。
(3)经果胶酶处理的果汁比较稳定，不易发生混浊，在制备浓缩果汁时，果胶酶的作用显得尤为重要。
(4)在葡萄酒酿造中加入果胶酶能起到澄清作用，还可促使葡萄汁中的酒石酸发生沉淀。
(5)果胶酶可用于橘子脱囊衣，制造果粉和低糖果冻。
2.果胶酶在饲料工业中的主要应用
(1)果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶等配合，可降解植物细胞壁中的果胶和纤维素，促使淀粉、脂质、维生素和蛋白质等释放出来，从而提高饲料的营养价值。
(2)果胶酶可降低饲料的黏度，促进饲料在动物消化道内的消化吸收。在饲料实验中，采用肉鸡配合饲料，对二周龄至七周龄的肉鸡进行饲料实验，添加果胶酶(100 IU/kg)和纤
维素酶的实验组与对照组增重相同，但进食量大大减少，表明具有较好的经济效益。
3.果胶酶的特点
酶活性高，产品可直接使用，不需提取，成本低；投资少，上市快；酶系全，应用效果
好。
(2012·周口高二检测)我国水果生产发展迅速，由于收获的季节性强，易造成积压，腐烂变质，为了解决上述问题且满足不同人群的需求，可以加工制作果汁、果酒、果醋等。在果汁生产中用到果胶酶，某课题研究小组为了探究果胶酶的某些特性，进行了如下实验：
Ⅰ.实验方法：按如图所示的顺序进行操作。
例2
Ⅱ.实验结果：对照组与实验组进行了相同时间的实验，结果如图所示：
(1)图中自变量是温度，除此之外还可以为________。
A．酶的浓度 B．苹果泥的量
C．水的加入量 D．pH
(2)图中的纵坐标还可以用________来表示。
(3)实验小组改变了实验条件后重复做实验，得到曲线乙，苹果汁的澄清度最高点对应的横坐标在同一位置的原因是
_______________________________。
【思路点拨】 解答此题的关键有两点：
①充分利用条件，确定实验变量（温度或pH）。
②分析坐标曲线图，理解最适温度的含义。
【解析】 本题主要考查了果胶酶活性的影响条件及实验分析能力。
(1)设计实验时，如果只改变温度，其他条件不变，则温度为自变量，同理pH亦可作为自变量。
(2)衡量实验结果的指标有两种：一是果汁的
量，二是果汁的澄清度。
(3)酶的活性受温度、pH等条件影响，却与底物的量、酶的浓度和水的加入量没有关系，所以每一种酶的最适温度和最适酸碱度是一定的。
【答案】 (1)D (2)苹果汁的体积
(3)同一种酶的最适温度是一定的，不会因酶的浓度、底物的量不同而改变
互动探究
假设坐标图中自变量为果胶酶用量，请画出苹果汁澄清度与果胶酶用量的变化曲线，并且用a点标出果胶酶的最适用量。
【提示】
变式训练
2.在果汁生产中加入果胶酶的目的是( )
A．分解纤维素
B．增加果汁的黏稠度
C．增加果汁的营养成分
D．使榨取果汁变得更容易并使果汁澄清
解析：选D。果胶酶能够分解细胞壁中的果胶，使果汁的榨取更容易，同时还将多聚半乳糖醛酸水解，使果汁变得澄清。
加酶洗衣粉和普通洗衣粉的相关问题
加酶洗衣粉 普通洗衣粉
成分 普通洗衣粉成分＋酶制剂(0.2%～0.5%) 主要含有表面活性剂、聚磷酸盐(水软化剂)、碱剂、漂白剂、荧光增白剂等
种类 ①单一加酶洗衣粉：加入一种酶制剂。
②复合加酶洗衣粉：加入多种酶制剂 ①根据含磷量分为无磷和含磷洗衣粉。②根据洗涤效果分为普通和浓缩洗衣粉
1.加酶洗衣粉和普通洗衣粉的比较
加酶洗衣粉 普通洗衣粉
作用 将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易溶于水，使污染物与纤维分开 “亲油基”与油污“抱成一团”，相互融合，形成亲水的微小胶团，然后油污与洗涤剂一起被清水冲掉
环境
影响 污染轻甚至无污染 导致水体发生富营养化，破坏水质，污染环境
相同
点 表面活性剂产生泡沫，将油脂分子分散开，水软化剂可以分开污垢
2.影响洗涤效果的因素
酶制剂的种类，污物的类型，水温、水量、水质，衣物的质地、大小，洗衣粉的用量，浸泡和洗涤时间等。
(1)在探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件实验中，水温是我们要研究的对象，实验自变量是水温。
(2)在探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤效果的不同实验中，实验自变量为洗衣粉的种
类。
(3)在探究不同种类加酶洗衣粉洗涤效果的实验中，实验自变量为加酶洗衣粉的种类。
(4)在设计实验时，除实验自变量可改变外，其他变量应在实验中保持不变。
(5)实验自变量的设置应根据实际情况来确定。如：选择什么样的水温进行实验，需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。
(6)洗涤方式和材料的选择。洗涤方式采用全自动洗衣机比较好，并且应尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，可以控制布料的大小、颜色以及污物的量，使其相同；同时，也便于洗涤效果的比较。
(7)水量、水质和洗衣粉用量的问题。水的用量和布料的大小是成正比的。做实验用的布料不宜过大，水量不宜过多，但应该让布料充分浸泡在水中。
特别提醒
①加酶洗衣粉需要水温在30 ℃～50 ℃为宜，切忌用70 ℃以上的热水，以防酶变性失活。
②加酶洗衣粉不宜长期存放，一般存储期为半年，若超过一年，酶的活力显著下降。
③加酶洗衣粉不能与强酸或强碱混合使用，避免酶的活性降低或失活。
④添加了碱性蛋白酶的洗衣粉可以分解人体皮肤表面蛋白质，使人患过敏性皮炎、湿疹
等，应避免与这类洗衣粉长时间接触。
下列有关探究某种加酶洗衣粉的最适温度的实验叙述中，正确的是( )
A．取一系列不同温度、其他条件相同的水，加入相同的污物及等量加酶洗衣粉，看哪一温度中酶的洗涤效果最好
B．在不同温度的水中，加入不等量洗衣粉，看哪种洗涤效果好
C．将加酶洗衣粉加入30 ℃水中，发现不如加到45 ℃水中洗涤效果好，说明45 ℃为最适温度
例3
D．将加酶洗衣粉与普通洗衣粉分别加入37 ℃的水中洗涤同样的污物，发现加酶洗衣粉洗涤效果好，说明加酶洗衣粉的最适温度为37 ℃
【思路点拨】 探究加酶洗衣粉的最适温度的实验中温度是自变量，其他无关变量要相同且适宜，保证实验的单一变量原则，以及实验要遵循对照原则。
【解析】 本实验的自变量为温度，在对照实验中，除了要观察的变量外，其他变量都应保持相同，B选项错误；C选项可以说明加酶洗衣粉在45 ℃时比30 ℃时洗涤效果好，但不能说明45 ℃为最适温度，C选项错误；D选项只能比较加酶洗衣粉与普通洗衣粉的洗涤效果，不能得出加酶洗衣粉的最适温度，D选项错误。
【答案】 A
变式训练
3.用加酶洗衣粉洗涤衣物时，下列说法正确的是( )
A．可用加酶洗衣粉洗涤毛料衣服
B．一般先用热水泡开，然后调至适宜温度
C．水温太低使洗衣粉中的酶丧失活性后不能再恢复
D．使用添加了碱性蛋白酶的洗衣粉洗衣服后应立即冲洗双手
解析：选D。毛料衣服的主要成分为蛋白质，加酶洗衣粉中的蛋白酶会损伤衣服；高温会使酶失活，而低温抑制酶的活性，但不会使酶变
性；手上皮肤中的蛋白质也会被加酶洗衣粉中的蛋白酶水解，损伤皮肤。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
探究温度对果胶酶活性的影响
实验温度(℃) 30 35 40 45 50 55 60 65 70
果汁量(mL)
【问题与探究】
1.为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？
【提示】 可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了苹果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题。
2.为什么能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？
【提示】 果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反应了果胶酶催化分解果胶的能力。在不同的温度和pH下，果胶酶的活性越大，苹果汁的体积就越大。
探究不同种类的加酶洗衣粉的洗涤效果
1.原理：酶的催化作用具有专一性，一种酶只能催化某一种或某一类化学反应，而复合酶洗衣粉加入的酶制剂种类较多，所以相对单一加酶洗衣粉来说，复合酶洗衣粉对各种污渍都有较好的洗涤效果。
2.实验变量：加酶洗衣粉的种类。
3.方法步骤
(1)将制备好的各种类型的污渍物等分成三份。
(2)取三个1000 mL的烧杯，各加入500 mL水和1 g不同类型的洗衣粉。
(3)将污渍物分别放入三个烧杯中，用玻璃棒搅拌相同时间。
(4)观察比较实验结果。
【问题与探究】
3.为什么不同洗衣粉的洗涤效果不同？
【提示】 不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶具有专一性，所以对不同污渍洗涤效果不同。
特别提醒
①实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后可进行重复滴加；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同。
②加酶洗衣粉的种类较多，要注意实验用的加酶洗衣粉的说明书，是单一加酶洗衣粉还是复合加酶洗衣粉，要用能有效分解污染物的加酶洗衣粉。
【例题】 (2012·扬州高二检测)某同学用含不同种类酶的洗衣粉进行了如下实验
组别 布料面积 污渍 水温
A(蛋白酶洗衣粉) 6×6 cm2 蛋白膜 40 ℃
B(脂肪酶洗衣粉) 6×6 cm2 蛋白膜 40 ℃
C(蛋白酶洗衣粉) 6×6 cm2 淀粉膜 40 ℃
请回答以下问题：
(1)该实验的目的是探究________________。该实验还应控制的无关变量为________。该实验中________分别构成两组对照实验。
(2)该同学在实验过程中可通过观察________来判断酶的催化效率。
(3)蛋白酶洗衣粉的去污原理是________________________________________________________________________。
(4)大力推广使用加酶洗衣粉代替含磷洗衣粉，有利于生态环境的保护，这是因为____________________________________。
【解析】 解答本题的关键，在于对探究实验过程的理解和把握。从表中信息可知，自变量有酶种类的不同和污渍的不同，根据单一变量原则，A和B相互对照，是探究不同酶对同一底物的催化作用；A和C相互对照，则是探究同一种酶对不同底物的催化作用。
两种情况其实都是探究酶催化作用专一性的。除了表中的布料大小、水温等无关变量，其他还应控制的无关变量有水的pH、洗衣粉的用量
等。酶催化的效率用蛋白膜消失时间的长短来判断，不能答成蛋白膜消失时间。
【答案】 (1)酶的催化作用具有专一性 洗衣粉的用量、水的pH等 A与B、A与C
(2)蛋白膜消失时间的长短
(3)在蛋白酶的催化作用下，蛋白质分子水解的产物溶解到水中
(4)蛋白酶进入环境后易被微生物分解，且可避免过多的磷进入水体造成水体富营养化(共54张PPT)
(二) 运用发酵技术制作豆腐乳和泡菜
学习导航
1.以制作腐乳为例了解传统发酵技术的应用，说明腐乳制作的科学原理。(重点)
2．说出泡菜制作的原理，并尝试制作泡菜。(难点)
新知初探 思维启动
毛霉
蛋白酶
淀粉酶
氨基酸
2.工业上批量生产豆腐乳的步骤
接种孢子：制作好腐乳坯后，喷洒
________________，使每块腐乳坯周身沾上_________________。
毛霉孢子悬液
毛霉孢子悬液
20 ℃左右
热量和水分
皮衣
装坛
析出水分
增多
3.腐乳制作实践
(1)制作腐乳坯
①消毒方法：______________。
②毛霉来源：____________________。
(2)装入容器
①腐乳坯的放置：间隔约1 cm，与容器内壁之间留有空隙，加盖，但要与外界相通，以便__________，有利于毛霉生长。
沸水消毒
空气中的毛霉孢子
通气散热
②毛霉生长的最适温度：____________。
(3)定时观察毛霉生长状况
①表面出现_______毛绒状菌丝后→翻动腐乳坯→当菌丝变成_________并有大量灰褐色孢子时→停止发酵。
②整个过程尽可能做到无菌操作，若发现杂菌应重做。
16℃左右
白色
淡黄色
(4)配制腐乳浸液
①组成：一般由食盐、水和料酒、辛香料等组成。
②料酒的作用：抑制杂菌的生长，也使腐乳具有独特的香味。
③辛香料的作用：调节风味，也有防腐的作
用。
(5)装瓶密封腌制
腐乳吃起来味道香美，其香味产生的原因是什
么？
提示：香味产生是由于毛霉产生的蛋白酶和脂肪酶将相应的有机大分子分解成小分子，除此之外，还与加入酒和香辛料有关。
想一想
二、制作泡菜
1.乳酸细菌的生物学特征
(1)代谢方式：________________。
(2)分布：________、土壤、植物体表等。
(3)作用：在厌氧条件下能分解己糖产生
_________。
(4)应用：畜牧业上制造___________，乳品厂制造酸奶，日常生活腌制泡菜等。
异养厌氧型
空气
乳酸
青贮饲料
2.泡菜制作流程
(1)准备容器并配制泡菜液
①制作泡菜液的关键：____________。
②调料的分类：辅料和香料。
③辅料包括：白酒、料酒和辣椒等。
(2)加工蔬菜：将洗净的蔬菜加工成条状、片状或块状，沥干或晾干待用。
配制调料
(3)制作泡菜：装瓶后，注入制备好的泡菜液至刚好___________，_______容器，置于阴凉处自然发酵7 d～10 d。
浸没原料
密封
(1)制作泡菜离不开乳酸菌的无氧发酵。(√)
(2)泡菜制作过程中蔬菜中的维生素被破坏。
(×)
(3)泡菜制作过程中添加的调料只是调节风味。
(×)
(4)泡菜制作过程中所利用的乳酸菌最初是所选蔬菜自身原有的。(√)
判一判
要点突破 讲练互动
腐乳制作的原理、具体操作步骤及注意事项
1.实验原理
(1)参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。
(2)毛霉是一种丝状真菌，常见于空气、土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌
丝。
(3)毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
2.制作的过程
让豆腐长出毛霉→加盐腌制→加腐乳浸液装瓶→密封腌制。
3.操作步骤
(1)选材：所用豆腐的含水量为70%左右最适
宜，水分过多腐乳不易成形，过少则不利于毛霉的生长。
(2)切块：将豆腐切成4 cm×4 cm×1.5 cm的小块。
(3)接种：为了提高毛霉的纯度，也可以将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上。
(4)压坯：为防止杂菌从瓶口进入，在接近瓶口表面放食盐时要铺厚一些。长满毛霉的豆腐块中盐的含量控制在16%左右。
(5)装瓶：在配制腐乳浸液时，可根据口味不同而配以各种不同的香辛料。在常温条件下，一般6个月即可食用。
4.注意事项
(1)控制好材料的用量
盐 酒(12%)
过高 过低 过高 过低
影响腐乳口味 不足以抑制微生物生长，导致豆腐腐败变质 腐乳成熟时间延长 不足以抑制微生物生长，导致豆腐腐败变质
(2)控制适宜的温度：毛霉的最适生长温度为16 ℃左右，该温度既能使毛霉快速生长又不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，从而保证发酵时间和腐乳的风味。
(3)防止杂菌污染。
特别提醒
①在实验操作中控制材料用量时，首先要明确加入物质的作用，然后分析加入过多或过少将出现的现象和结果。
②腐乳质量的评价：制作成功的腐乳应色泽基本一致、味道鲜美、咸淡适口、无异味、块形整齐、质地细腻、无杂质。
下列关于腐乳制作原理的叙述，不正确的是( )
A．是多种微生物协同作用的结果
B．制作初期，主要是毛霉在发挥作用
C．红腐乳散发出的酒香是由毛霉产生的
D．现代食品企业是在无菌条件下接种毛霉生产豆腐乳
例1
【思路点拨】 本题考查腐乳制作的原理。可从参与腐乳发酵的微生物种类、发酵各阶段的变化以及传统生产和现代工业生产方法的异同等角度入手解答本题。
【解析】 腐乳发酵过程需要青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种微生物的共同参与，其中起主要作用的是毛霉。腐乳制作的前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐(白坯)上的生长。
红腐乳散发出的酒香应该是由腐乳浸液或酵母菌代谢产生的，毛霉代谢不能产生酒精。现代的腐乳生产是在无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品质量。
【答案】 C
1.腐乳制作的一般流程是( )
①让豆腐长出毛霉 ②加盐腌制 ③加腐乳浸液装瓶 ④密封保存
A．①②③④ B．①③②④
C．②①③④ D．①④③②
解析：选A。腐乳制作的一般流程是让豆腐长出毛霉→加盐腌制→加腐乳浸液装瓶→密封保存。
变式训练
1．泡菜发酵过程分为三个阶段
(1)发酵初期：不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵，发酵产物为乳酸、乙醇、醋酸和二氧化碳等。此时泡菜液的含酸量约为0.3%～0.4%，是泡菜初熟阶段，其菜质咸而不
酸、有生味。
泡菜的发酵过程及制作过程的注意事项
(2)发酵中期：乳酸不断积累，pH下降，乳酸菌开始活跃，并进行同型乳酸发酵。大肠杆菌、腐败菌、酵母菌和霉菌的活动受到抑制。这一期间为泡菜完全成熟阶段，泡菜有酸味而且清香。
(3)发酵后期：乳酸含量继续增加，当乳酸含量达到12%以上时，乳酸菌的活性受到抑制，发酵逐渐停止。此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。
从乳酸的含量、泡菜的风味品质来看，当乳酸含量为0.4%～0.8%时，泡菜的风味品质最好，因
此，常以这个阶段作为泡菜的成熟期。
2.泡菜制作过程中的注意事项
(1)泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环
境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂；装坛时压实，泡菜液浸没菜体；泡制期间不宜开盖。
(2)盐水按水盐质量比4∶1配制，煮沸冷却后待
用。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀死盐水中的其他细菌。制作泡菜时食盐的作用：一是防腐，一般有害菌的耐盐力差；二是使蔬菜组织中水分析出，使成品质地柔韧、咀嚼感强。盐的用量宜控制在10%～15%。过
高，乳酸发酵受抑制，风味差；过低，杂菌易繁殖引起变质。
(3)材料装坛时预留1/4空间，不宜过满。
(4)封坛时应严格控制密封，以保证乳酸菌所需的无氧环境。
(5)注意控制温度、食盐水浓度和发酵时间。以30 ℃左右为宜，温度过高，食盐水浓度低于10%，腌制时间过短，会造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量升高；食盐水浓度过高，则会使泡菜口味不佳，甚至影响乳酸菌的发酵。
(2012·常州高二检测)生活中泡菜的制作方法：将新鲜的蔬菜经过整理、清洁后，放入彻底清洗并用白酒擦拭过的泡菜坛中，泡菜坛一般是两头小中间大的陶器，坛口有坛沿，凡裂缝的菜坛不能用。然后加入盐水、香料及一些“陈泡菜水”，密封后置于阴凉
处，最适环境温度为28～32 ℃。有时制作的泡菜会“咸而不酸”或“酸而不咸”，前者是用盐过多，后者是用盐过少。
例2
(1)用白酒擦拭泡菜坛的目的是____________________________________。
(2)菜坛要密封的原因是__________________________________，
若菜坛有裂缝，可能会出现的结果是__________________________________。
(3)若制作的泡菜“咸而不酸”，最可能的原因是_________________________________。
(4)加入一些“陈泡菜水”的作用是_________________________________。
(5)制作泡菜的过程中，有机物的干重如何变化？菜坛内有机物的种类如何变化？___________________________________。
【解析】 本题主要考查泡菜制作过程及条件控制，分析如下：
(1)用白酒擦拭的目的是消毒，避免泡菜坛中的微生物影响发酵过程。
(2)菜坛密封，是为了形成无氧环境，为乳酸细菌提供适宜环境；若菜坛有裂缝，则会抑制乳酸细菌的发酵，导致好氧微生物大量繁
殖，使泡菜腐败变质。
(3)微生物生长需要适宜的渗透压，若外界浓度过高会使微生物失水死亡，不能完成乳酸发酵。
(4)“陈泡菜水”里面乳酸细菌含量丰富，利于泡菜的快速发酵。
(5)乳酸细菌在进行发酵时，将消耗有机物中的能量，同时将大分子物质分解成许多小分子物质。
【答案】 (1)消毒
(2)乳酸细菌是严格的厌氧型生物 抑制乳酸细菌发酵，导致好氧微生物大量繁殖，使发酵失败
(3)盐的浓度过高，使乳酸细菌失水死亡，没有生成乳酸，或产生乳酸过少
(4)提供乳酸细菌菌种，使其在短时间内形成菌种优势
(5)有机物干重减少，种类增多
变式训练
2.利用乳酸菌制作泡菜因操作不当造成泡菜腐烂，下列原因中正确的是( )
①罐口密闭缺氧，抑制了乳酸菌的生长繁殖
②罐口封闭不严，氧气抑制了乳酸菌的生长繁殖
③罐口封闭不严，氧气抑制了其他腐生菌的生长和繁殖
④罐口封闭不严，促进了需氧腐生菌的生长和繁殖
A．①③ B．②④
C．②③ D．①④
解析：选B。制作泡菜要注意坛口的密封，封闭不严，氧气进入会抑制乳酸菌的生长繁殖，也会导致需氧腐生菌的生长，使泡菜腐烂变质。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
制作腐乳的过程
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加腐乳浸液装瓶→密封腌制。
制作腐乳
1.毛霉的生长
选择含水量为70%的豆腐，在无菌条件下，接种优良的毛霉菌种，将温度控制在16 ℃左
右，并保持一定的湿度，在20 ℃左右培养20 h后，每隔6 h上下层调换一次，以更换新鲜空
气，并观察毛霉生长情况。44～48 h后，腐乳坯上毛霉呈棉絮状，菌丝下垂，顶端已长出孢子囊，菌丝已包围豆腐坯。
2.加盐腌制
将长满毛霉的豆腐块分层摆放在瓶中，同时逐层加盐，越接近瓶口，越要增加盐量。这是因为加盐既能析出豆腐中的水分，使豆腐变硬，又能抑制杂菌的生长，避免豆腐块腐败变质。
3.配制腐乳浸液
腐乳浸液是由酒及各种香辛料配制而成，酒可以选择料酒、黄酒、米酒、高粱酒等，加酒可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味，含量一般控制在12%左右；香辛料可以调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。不同颜色、不同风味的腐乳，和加入的香辛料及酒有关。
【问题与探究】
1.为什么选用含水量为70%的豆腐呢？
【提示】 这是因为含水量为70%的豆腐易于成形，含水量过高的豆腐不易成形，含水量过低的豆腐，影响毛霉的发酵。
2.加盐为什么能抑制微生物的生长？
【提示】 因为高渗溶液能使微生物细胞渗透失水死亡，所以越接近瓶口，盐越要铺厚一些，防止杂菌的污染。
3.配制腐乳浸液时，一般将酒精含量控制在12%左右，过高过低都不行，为什么？
【提示】 酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
【例题1】 下列关于腐乳制作的描述中，错误的是( )
A．腐乳坯装坛后应密封腌制
B．为了让豆腐上更多更快地长出毛霉，温度应为16 ℃左右，并保持一定湿度
C．菌种的选择和用量会影响腐乳的口味
D．豆腐发酵过程中，毛霉消耗的能量来自脂肪的分解
【解析】 腐乳坯装坯后应密封腌制，以防止杂菌污染；毛霉生长最适温度为16 ℃左右，并有一定的水分；制作腐乳的菌种需要选择不产毒素，生长繁殖快，有蛋白酶、脂肪酶、肽酶及有益于腐乳质量的酶系，才能使产品质地细腻柔滑，气味良好；豆腐发酵过程中，毛霉消耗的能量主要来自葡萄糖的分解。
【答案】 D
制作泡菜
【操作与实践】
1.准备容器并配制泡菜液：准备并清洗制作泡菜的容器。制作泡菜液的调料包括辅料和香
料。辅料有白酒、料酒和干红辣椒等。
2.加工蔬菜：将洗净的萝卜、白菜、卷心菜、甘蓝、豆角、莴苣、芹菜、辣椒等加工成条状、片状或块状，沥干或晾干待用。
3.制作泡菜：将加工好的蔬菜装入瓶中，压
紧，注入制备好的泡菜液至刚好浸没原料，密封容器，置于阴凉处自然发酵 7～10 d。
【问题与探究】
4.制作泡菜液的关键是什么？调料的作用是什
么？调料包括哪些物质？
【提示】 制作泡菜液的关键是配制调料。调料是泡菜风味形成的关键，包括辅料和香料。
5.制作泡菜中加入辅料和香料起到什么作用？
【提示】 辅料有白酒、料酒和干红辣椒等。蔬菜入坛泡制时，白酒、料酒起到辅助盐分渗透、保持蔬菜嫩脆、杀菌等作用，干红辣椒则起调和风味、增加鲜味的作用。香料包括八角、花椒、胡椒等。香料具有增香、除异味等功效。
【例题2】 下列关于果酒、果醋、腐乳和泡菜制作的叙述，正确的是( )
A．在果酒的制作过程中，应先去除葡萄的枝梗，再进行多次反复冲洗，这样才可以洗得彻底
B．果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳
C．豆腐上长了毛霉以后，需要加盐腌制8天左右，这样可以抑制其他微生物的生长，避免豆腐变质，又能使豆腐析出水分，使豆腐块变硬
D．制作泡菜时要选用火候好、无裂纹、无砂眼、盖子吻合好的泡菜坛子，坛子需要加水密封的目的是隔绝空气，抑制细菌繁殖
【解析】 在果酒的制作过程中，应先冲洗后再去除葡萄的枝梗；果酒制作中充气泵不需进行充气；制作泡菜时加水密封的目的是创造有利于乳酸菌发酵的无氧环境。
【答案】 C(共61张PPT)
第一章 无菌操作技术实践
第一章 无菌操作技术实践
第一节 微生物的培养和应用
(一) 微生物培养基的配制
学习导航
1.掌握培养基的用途和种类。(重点)
2．能区别消毒和灭菌，会运用常用的消毒、灭菌方法。(难点)
3．了解培养基的配制过程及培养基的配制原
则。(重点)
新知初探 思维启动
繁殖
代谢产物
天然培养基
(2)按物理状态可分为液体培养基、半固体培养基和_______培养基。________是最理想的
凝固剂。
(3)按功能可分为基础培养基、加富培养基、_______________和鉴别培养基。培养基中加入链霉素，即可达到抑制_______________的生长，将_________分离出来；培养基中添加______________，能区分大肠杆菌和产气肠杆
菌。
固体
琼脂
选择培养基
细菌和放线菌
真菌
伊红—美蓝
1．(1)天然培养基取材便利、营养丰富、配制简便、实验结果的重复性好。(×)
(2)各种培养基尽管配方不同，但一般都有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。(√)
(3)利用无氮培养基可筛选出固氮细菌，这属于鉴别培养基的应用。(×)
(4)液体培养基、半固体培养基及固体培养基的主要区别在于是否加入琼脂及加入的多少。(√)
判一判
二、消毒与灭菌
消 毒 灭 菌
概念 用较______的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物(包括
_____________和有害微生物的__________)，实际上是部分灭菌 采用________的物理或化学方法使物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 高温灭菌，可分为
______灭菌和______灭菌两大类
温和
病原微生物
营养细胞
强烈
干热
湿热
高温灭菌是利用高温的致死作用，使微生物的蛋白质和核酸等重要的生物大分子发生不可逆转的变性，你知道高温破坏的是蛋白质的哪一结构吗？
提示：高温使蛋白质内部的氢键断裂，从而破坏其空间结构，但并不破坏肽键。
想一想
三、细菌培养基的配制过程
1.配制过程
配制培养液→_________→分装→包扎→
_______→__________。
2.几种天然有机营养物质的主要成分
调节pH
灭菌
搁置斜面
营养物质 主要成分
牛肉浸膏 富含_____________、有机氮化合物、维生素、盐等
蛋白胨 富含_________________、一些维生素和糖类
水溶性糖类
有机氮化合物
3.细菌、放线菌、真菌生长的最适pH分别为___________、__________、___________。
营养物质 主要成分
酵母浸膏 富含__________B类、有机氮化合物和糖类
维生素
6.5～7.5
7.5～8.5
5.0～6.0
2．(1)培养基调节合适的pH后就可以接种使
用。(×)
(2)牛肉膏只能为微生物提供碳源和氮源。(×)
(3)制备细菌培养基操作顺序为配制培养液、调节pH、灭菌、分装。(×)
判一判
要点突破 讲练互动
培养基的种类和用途
标准 培养基
类型 配制特点 主要应用
物理性质 固体培养基 加入琼脂较多 菌种分离、鉴定、计数
半固体培养基 加入琼脂较少 菌种保存
液体培养基 不加入琼脂 工业生产、连续培养
标准 培养基
类型 配制特点 主要应用
化学组成 合成培养基 由已知成分配制而成，培养基成分明确 分类、鉴定
天然培养基 由天然成分配制而成，培养基成分不明确 工业生产
半合成培养基 部分天然物质和部分化学试剂配制而成 兼有天然培养基和合成培养基的优点
标准 培养基
类型 配制特点 主要应用
目的
用途 加富培养基 营养物质仅适合一种或一类微生物 能使某种微生物的生长、繁殖比其他微生物更加迅速、逐渐淘汰其他微生物
鉴别培养基 添加某种指示剂或化学药剂 菌种的鉴别
选择培养基 添加(或缺少)某种化学成分 菌种的分离
特别提醒
判定培养基的类型及所培养微生物的生活方式的方法：
①培养基中是否含有有机物：若有，则培养的微生物为异养型微生物；若无，则培养的微生物为自养型微生物。
②是否含有琼脂：若有，则该培养基为固体培养基。
③是否含有一些特殊物质：如含有青霉素、高浓度盐等，用于抑制不需要的微生物的生
长，而促进所需微生物的生长的培养基为选择培养基；如含有伊红?美蓝等，用于区分不同微生物种类的培养基为鉴别培养基。
根据各类微生物的形态结构特点和新陈代谢类型，利用选择培养基和鉴别培养基，结合显微镜镜检，以及菌落特征，可以把混杂在一起的大肠杆菌、硝化细菌、乳酸细菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、圆褐固氮菌分离开来。下面是分离筛选的方法步骤，请根据各个步骤的条件，填写空格中的内容：
例1
首先配制一系列不同性质的固体培养基，然后进行高温灭菌。再将上述微生物的混合液分别接种到各种培养基上培养。
(1)用无氮培养基可筛选出_________________________________。
(2)用不含有机碳源的选择性培养基可筛选出_________________________________。
(3)酵母菌的筛选需要在常规培养基中另加入_________________________________。
(4)用加了较高浓度NaCl的培养基可选择出_________________________________，
或者根据菌落的颜色呈现________色，将其挑取单独培养。
(5)利用伊红?美蓝培养基培养混合菌，菌落呈________色并带有金属光泽的是________，挑取该菌落单独培养。结合显微镜镜检和进一步用伊红?美蓝培养基鉴别来确定。
(6)在无氧环境下培养混合菌，________________________可以生长。加入一定浓度的乳酸，使培养基pH充分降低，可抑制________微生物的生长，利用菌落特征，结合显微镜镜检，选取生长优势的菌落，即可分离出________。
【解析】 若培养基中无氮，则凡是不能自生固氮的微生物均不能生存，题中所列微生物
中，只有圆褐固氮菌能固氮，因而无氮培养基可选出该菌；若用不含有机碳的培养基则可选出自养型微生物；真菌的筛选可在培养基中加入青霉素；高浓度NaCl可选出耐盐微生物，如金黄色葡萄球菌；用伊红?美蓝培养基可鉴定大肠杆菌；在无氧环境中，厌氧型及兼性厌氧型微生物才能生长，需氧型微生物将被抑制。
【答案】 (1)圆褐固氮菌 (2)硝化细菌 (3)青霉素
(4)金黄色葡萄球菌 桔红(金黄)
(5)绿 大肠杆菌
(6)大肠杆菌、乳酸细菌、酵母菌 大肠杆菌和酵母菌
乳酸细菌
1.在培养微生物的培养基中加入某些物质能分离出所需的微生物。下列选项中，前者是在培养基中加入的物质，后者是能被分离出的微生物，其中正确的是( )
A．氢氧化钠，酵母菌
B．盐酸，放线菌
C．适量的青霉素，霉菌
D．适量的伊红?美蓝，大肠杆菌
变式训练
解析：选C。氢氧化钠、盐酸分别为强碱、强酸，酵母菌和放线菌都不能生存，加入
伊红—美蓝的培养基是用来鉴定大肠杆菌，并不能分离大肠杆菌。适量的青霉素对原核生物有抑制作用，对真核生物的生命活动并不影响。
1．营养要素
微生物的化学组成与其他生物大体相同，也是由C、H、O、N、P、S等元素组成，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素主要来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。这些化合物归纳成碳源、氮源、生长因子、无机盐和水这五大类营养要素。
培养基中各营养要素的作用及配制原则
营养要素 含义 作用 主要来源
碳源 凡能提供所需碳元素的物质 构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机化合物：CO2、NaHCO3；
有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等
氮源 凡能提供所需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
营养要素 含义 作用 主要来源
生长
因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
水 在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高 不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
无机盐 为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
特别提醒
①对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是单一方面的作用。
②有些微生物需添加特殊营养物质，原因是它们自身缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
2.配制原则
(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的
等)，如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物
质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌、放线菌和真菌的最适pH分别
为：6.5～7.5、7.5～8.5和5.0～6.0。
(2012·盐城高二检测)分析有关微生物的资料，回答问题。
(1)1982年澳大利亚学者从胃活检组织中分离出幽门螺杆菌。幽门螺杆菌的遗传物质集中分布的区域称为________________________________________________________________________。
例2
(2)如图4支试管分别代表4种微生物在半固体培养基(琼脂含量3.5 g/L)中的生长状态，其中②号试管代表幽门螺杆菌的生长状态，由图判断，该菌在_______________________________________________________________________________________________________________________________________________条件下不能生长。
(3)下表是某培养基的配方。
将幽门螺杆菌接种到pH适宜的该培养基中，置于37 ℃下培养一段时间后，在该培养基中幽门螺杆菌的数目比刚接种时________，主要原因是_______________________。
成分 葡萄糖 KH2PO4 MgSO4 NaCl CaSO4 CaCO3 琼脂 蒸馏水
含量 10 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 5 g 3.5 g 1 L
(4)幽门螺杆菌形态如图所示，该菌在人体中可引起胃溃疡等胃部疾病。幽门螺杆菌生长的最适pH为6～7，人体胃腔内pH在1～2之间，但胃黏膜的黏液层靠近上皮细胞侧pH为7.4左右。若幽门螺杆菌随食物进入胃腔，结合其结构特点以及能导致胃溃疡的特性，推测该菌在胃内如何存活？_____________________。
【思路点拨】 本题主要考查微生物培养的相关知识，解答本题应明确以下几点：
①了解幽门螺杆菌的生活习性。
②了解培养基的营养成分组成。
③区别原核生物和真核生物。
【解析】 (1)幽门螺杆菌为原核生物，没有核膜包围的细胞核，遗传物质集中在拟核内。
(2)幽门螺杆菌生活在半固体培养基的中部，说明它不能生活在氧气浓度过高或过低的地方。
(3)培养基中缺乏氮源，幽门螺杆菌不能正常生
活，数量会减少。
(4)幽门螺杆菌进入胃腔后，可以先依靠鞭毛运动至pH较高处缓冲，然后分泌蛋白中和胃酸，提高pH，以便继续生存和繁殖。
【答案】 (1)拟核(核区)
(2)氧气浓度过高或过低
(3)少 缺少氮源(缺少氮源和生长因子)
(4)幽门螺杆菌进入胃腔后，首先依靠鞭毛运动至pH较高处缓冲，然后分泌蛋白中和胃酸，提高pH，以便继续生存和繁殖
变式训练
2.微生物在生命活动过程中，需要不断从外界吸收营养物质。下列有关微生物营养物质的叙述，正确的是( )
A．不同种类的微生物，对碳源的需要情况差别不大
B．无机氮源不能为微生物的生命活动提供能源
C．除水以外的无机物仅提供无机盐
D．蛋白胨可以为微生物的生命活动提供碳源、氮源、生长因子
解析：选D。异养型的微生物需要有机物作碳源，自养型微生物需无机物作碳源；无机物NH3不仅能为硝化细菌提供能量，还能作为其氮源，不仅能为其生命活动提供无机盐，还能调节pH等，故前三项均错。蛋白胨可为微生物提供碳源和氮源，水解后的氨基酸还可为微生物提供生长因子。
项目 概念 常用方法 应用的范围
消毒 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体上绝大多数微生物(包括病原微生物和有害微生物的营养细胞) 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min 一般物品
灭菌与消毒
项目 概念 常用方法 应用的范围
消毒 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体上绝大多数微生物(包括病原微生物和有害微生物的营养细胞) 巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 一些不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法 如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
紫外线消毒法：30 W紫外灯照射30 min 接种室
项目 概念 常用方法 应用的范围
灭菌 使用强烈的物理或化学方法使物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力 灼烧灭菌：酒精灯火焰 接种工具的灭菌
干热灭菌：160～170 ℃下灭菌1～2 h 玻璃器皿、金属工具的灭菌
高压蒸汽灭菌：121 ℃条件下，灭菌15～30 min 培养基及容器灭菌
下面对发酵过程中灭菌的理解不正确的是( )
A．防止杂菌污染
B．消灭杂菌
C．培养基和发酵设备都必须灭菌
D．灭菌必须在接种前
【解析】 灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A项所述是灭菌的目的，
例3
因为发酵所用的菌种大多是单一纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物(杂菌)，所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的。D也是正确的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
【答案】 B
变式训练
3.高温灭菌的原理是( )
A．每种微生物生长的最适温度都是一定的
B．微生物对于高温环境不适应
C．高温破坏了微生物细胞内的蛋白质结构，从而使其失去侵染性
D．高温降低了环境中氧的浓度
解析：选C。蛋白质是生物体生命活动的承担者和体现者，核酸可控制生物体的代谢活动。高温可使蛋白质和核酸变性失活，从而影响微生物的生命活动。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
细菌培养基的配制
【问题与探究】
1.培养基灭菌后，为什么需要冷却到50 ℃左右时，才能用来搁置斜面或倒平板？你用什么办法来估计培养基的温度？
【提示】 琼脂的凝固点为40 ℃，温度太高易使培养皿破裂，低于40 ℃，培养基已凝固，倒不出，所以培养基灭菌后，需冷却到50 ℃左右时才能用来倒平板，可以用手触摸盛有培养基的试管，感觉试管的温度下降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使试管口通过火焰？
【提示】 通过灼烧灭菌，防止试管口的微生物污染培养基。
3.为了能彻底灭菌，在操作过程中应注意哪些事项？
【提示】 使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅的压力(100 kPa)、温度(121 ℃)和灭菌时间(20 min)。
【例题】 下表为牛肉膏蛋白胨培养基的成分表，据表回答相关问题：
(1)蛋白胨在培养基中的主要作用是__________________________________。
成分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl H2O
含量 0.5 g 18 g 0.5 g 100 mL
(2)若用表中成分材料配制观察金黄色葡萄球菌菌落状况的培养基，还需要添加的成分是__________________________________。
(3)培养基配制好时，分装前应进行的工作程序是________________________________。
(4)从配制培养基直至接种培养，所采用的预防杂菌感染的方法是____________________________________。
(5)对培养基进行搁置斜面处理的目的是__________________________________。
【解析】 蛋白胨富含有机氮化合物、一些维生素和糖类，因此能为微生物生长提供氮源、生长因子
等。要观察菌落状况，需要固体培养基，培养基配制时加入琼脂作为凝固剂。培养基配制好分装前调节好pH。从配置培养基直至接种培养，所采用的预防杂菌感染的方法是灭菌。搁置斜面接种能增加菌种与培养基的接触面积，有利于培养微生物。
【答案】 (1)提供氮源和生长因子
(2)琼脂 (3)调pH (4)灭菌
(5)接种时增加菌种与培养基的接触面积，利于微生物培养(共44张PPT)
第二章 发酵技术实践
第二章 发酵技术实践
第一节 运用发酵技术加工食品
(一) 运用发酵技术制作果酒和果醋
学习导航
1.了解酵母菌、醋酸菌及其发酵原理。(重点)
2．掌握果酒、果醋的制作方法。(重点)
3．设计并安装简单的生产果酒和果醋的装置。
(重难点)
新知初探 思维启动
有氧或无氧
卵球形
兼性厌氧型
酒精发酵
(3)菌种来源：野生型酵母菌。
(4)最适温度：______________。
(5)酶制剂：__________________。
18～25℃
果胶酶和蛋白酶
制作果酒的过程中一直需要通气吗？如果制作葡萄酒，取材时你认为应先冲洗还是先除去枝
梗？
提示：不是。如果一直通气，没有酒精产生。正确的做法是先通气后密封。制作葡萄酒时，应先冲洗葡萄，然后再除去枝梗，从而避免除去枝梗时，引起葡萄损坏，增加被杂菌感染的机会。
想一想
好氧
乙醇
30～35℃
C2H5OH＋O2
霉菌
酵母菌
(1)果醋发酵包括无氧发酵和有氧发酵。(×)
(2)在制作葡萄醋的过程中，温度应严格控制在18～25 ℃。(×)
(3)醋酸菌含有细胞壁、细胞膜、线粒体、核糖体和细胞核。(×)
判一判
要点突破 讲练互动
果酒制作和果醋制作的比较
果酒制作 果醋制作
菌种 酵母菌 醋酸菌
菌种
特点 单细胞、真核生物，多以出芽方式进行无性生殖 单细胞、原核生物，分裂生殖
果酒制作 果醋制作
代谢类型 异养兼性厌氧型 异养好氧型
菌种来源 传统发酵过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。可以将葡萄皮上附着的酵母菌分离出来，获得纯净菌种或用人工培养的酵母菌 醋酸菌的菌种可以到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，也可从食醋中分离
(2012·徐州高二质检)如图所示为酵母菌细胞的构造模式图。请据图回答：
(1)从细胞核的构造看，酵母菌属于________生
物。
(2)写出1、3的结构名称：[1]________，[3]________。
例1
(3)与酵母菌细胞相比，醋酸菌最大的特点是没有_________________________________，
也没有图中1、2、3中的________(填写序号)。
(4)图中的酵母菌正在进行________生殖，而醋酸菌进行的是________生殖。
(5)用________________染料使染色体着色，发现一酵母菌细胞核中有17条染色体，该酵母菌是________倍体。
(6)酵母菌细胞出芽生殖的意义是________。
A．产生新个体 B．增加生命活力
C．增加变异性 D．改变遗传性
(7)用酵母菌制啤酒时，为保证发酵罐中有较多的酵母菌，必须先________，达到一定数量后，则应该________，以获得大量的________________________________________________________________________。
【解析】 本题以细胞结构图为题材，对学生所学内容进行综合考查。酵母菌是真核细
胞，有真正的细胞核以及线粒体等复杂的细胞器，而醋酸菌是原核细胞，没有真正的细胞核，只有核糖体一种细胞器；酵母菌在有氧气和养料充足的情况下，进行出芽生殖，在该过程中，遗传物质复制，然后平均分
配，所以芽体长大后与原来的母体细胞是一样的，在环境条件较差的情况下，也可进行
孢子生殖，而醋酸菌只能进行二分裂生殖；染色体可被醋酸洋红等碱性染料染成深色。
【答案】 (1)真核 (2)细胞壁 线粒体
(3)真正的细胞核 3 (4)出芽 二分裂
(5)醋酸洋红等碱性 单 (6)A
(7)通入氧气 密封装置 无氧发酵产生的酒精
1.下列关于酵母菌的叙述，错误的是( )
A．酵母菌是异养型的真菌
B．酵母菌是兼性厌氧型微生物，即一种酵母菌能进行有氧呼吸，另一种进行无氧呼吸
C．酵母菌在有氧存在时，能将葡萄糖分解成CO2和H2O
D．酵母菌的无氧呼吸产生酒精和CO2
变式训练
解析：选B。酵母菌是兼性厌氧型微生物，其异化作用特点是在有氧条件下进行有氧呼吸、在无氧条件下进行无氧呼吸。
1．制作果酒和果醋的实验流程
制作果酒和果醋的实验过程
2.结果评价与异常问题分析
(1)结果评价
①由于发酵作用，葡萄汁中糖分大部分转变为CO2和C2H5OH，及少量的发酵副产品。CO2排出越来越旺盛，使发酵液出现“沸腾”，CO2从排气口排出，在发酵10天后，现象最明显。发酵过程产热，会使发酵液温度上升，但酒精发酵温度应严格控制在18 ℃～25 ℃，发酵过程中，果皮上的色素及其他成分逐渐溶解于发酵液中。
②正常情况下，葡萄酒色泽鲜艳、爽口、醇厚、有浓郁的果实香味；果醋呈琥珀色或棕红色，具有特有的果香，酸味柔和、稍有甜味，不涩。
(2)发酵过程中常见异常情况分析
①发酵液浓度问题
因为发酵液中培养的是酵母菌和醋酸菌。如果发酵液浓度过高，会导致两者过度失水而死亡，最终得不到酒精或醋酸。在发酵过程中，发酵液的成分和浓度在不断地变化，要时刻注意发酵液浓度的变化。
②装置的气密性问题
果酒制作的酒精生成阶段发酵装置应该密闭；如果封闭不严，酵母菌不能进行无氧呼吸，也就不能产生酒精。
特别提醒
①果酒的制作是否成功的鉴定方法是：嗅味和品尝(初步检测)、用重铬酸钾检验酒精的存在(最终检测)。
②果醋的制作是否成功的鉴定方法是：观察菌膜的形成(初步检测)、嗅味和品尝(初步检测)、比较发酵前后的pH值(最终检测)、显微镜检测(最终检测)。
(2010·高考江苏卷)如图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是( )
例2
A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母菌细胞的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
【思路点拨】 本题主要考查果酒和果醋制作过程中的物质变化情况，解答本题应突破以下几点：
①果酒和果醋制作的原理、条件和过程。,
区别果酒和果醋的制作。
③比较有氧呼吸和无氧呼吸。
【解析】 据图分析，过程①是呼吸作用的第一阶段，过程②是无氧呼吸的第二阶段，过程③是有氧呼吸的第二、三阶段，过程④是果醋制作，其中过程①的反应场所是细胞质基质，有氧和无氧条件下均能进行，因此判断A、B项错误；过程③需要氧气参与，过程④利用的醋酸菌是好氧细菌，在将酒精转变为醋酸时需要氧的参与，由此判断C项正确；
酵母菌生长繁殖的最适温度在18 ℃～25 ℃，醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30 ℃～35 ℃，由此判断D项错误。
【答案】 C
互动探究
过程②、③产生的CO2会对溶液pH产生怎样的影响？过程④的最适温度是多少？
【提示】 会导致溶液pH下降。过程④的最适温度是30 ℃～35 ℃。
变式训练
2.下列评价果酒和果醋制作是否成功的方法中，不合理的是( )
A．通过观察相关微生物的存在或数量变化进行鉴定
B．通过向果酒发酵液中加入重铬酸钾试剂进行鉴定
C．通过检测果醋发酵前后发酵液的pH变化进行鉴定
D．通过检测果酒发酵前后发酵液的温度变化进行鉴定
解析：选D。果酒发酵的主要产物是酒精，同时有二氧化碳产生，与有氧呼吸相比，二氧化碳的产生量只是少些，所以酒精是无氧呼吸特有的产物，二氧化碳不是，可用重铬酸钾来检验酒精的产生；果醋发酵的主要产物是醋酸，醋酸呈酸性，可以通过pH试纸等方法来检验；
不管酵母菌是有氧呼吸还是无氧呼吸都会释放能量，引起发酵液前后温度变化，因此检测果酒发酵前后发酵液的温度变化无法确定是否进行酒精发酵。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
1.对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几
次，再用体积分数为70%的酒精擦拭消毒，晾干待用。
葡萄酒、果醋的制作
2.挑选优质葡萄500 g，用清水冲洗1～2遍去除污物(不要反复多次冲洗)，再去除枝梗。
3.用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中，或将葡萄打成浆后，用洁净的纱布过滤至发酵瓶中，盖好瓶盖。如果没有合适的发酵装置，可以用500 mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的2/3。
4.将发酵瓶置于适宜的温度下发酵。
5.由于发酵旺盛期CO2的产量非常大，因此需要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置，如瓶子(最好选用塑料瓶)，每天要拧松瓶盖2～4次，进行排气。
6.10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例
如，可以闻酒味、检验酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。
7.接着将葡萄酒的酒精浓度稀释至5～6度，然后接入5%～10%的醋酸菌液，搅匀，将温度保持在30 ℃，进行醋酸静置发酵。经过2～3
d，液面有薄膜出现，说明醋酸菌膜形成，一般1度酒精能产生1%的醋酸，发酵结束时的总酸度可达3.5%～6%。
【问题与探究】
1.制作葡萄酒的初期为什么会看到有大量气泡产
生？未经高温灭菌，后期果汁为什么不会腐败变
质？
【提示】 制作葡萄酒的初期，酵母菌进行有氧呼吸，产生大量CO2；后期缺氧，呈酸性，并且发酵液中有大量的酒精产生，在这种条件下，酵母菌仍能大量生长繁殖，而绝大多数其他微生物都无法适应这一环境而受到抑制。
2.怎样设计制作果酒和果醋的装置？
【提示】 设计果酒和果醋的发酵装置时应考虑以下几个方面：温度的控制、氧气供应状况的控制、发酵液的控制等方面。其简易发酵装置示意图中各个部件的作用以及该装置的使用方法(如图)。
充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。
出料口：用来取样。
该装置的使用方法：使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。
【例题】 某人在家制作果酒，发现发酵后毫无酒味。下列原因中正确的是( )
①瓶口密闭缺氧，抑制了醋酸菌的生长繁殖
②在制作中将葡萄汁煮沸消毒
③制作中先去枝梗再冲洗导致杂菌污染
④放置的温度过高，使得酵母菌发酵最终形成醋酸
A．①③ B．②④
C．②③ D．①④
【解析】 酿酒时，发酵液不宜装满，留出一定空间使酵母菌开始时能进行有氧呼吸，然后密闭在缺氧条件下。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精；葡萄汁发酵的菌株来自葡萄皮上的野生酵母菌，煮沸消毒会杀死菌种使发酵失败；
制作葡萄酒时要先冲洗再去枝梗，否则容易染杂菌，发酵失败；发酵温度过高会影响酵母菌的代谢，不能发酵产生酒精；形成醋酸是醋酸菌发酵的结果。
【答案】 C(共41张PPT)
第二节 制备和应用固定化酶
学习导航
1.固定化酶和固定化细胞的应用。(重点)
2．固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点)
新知初探 思维启动
固相载体
酶活性
水溶性
2.制备固定化酶
目前，制备固定化酶的方法主要有________、________、包埋法等。
(1)吸附法的显著特点是工艺简便且
____________，在生产实践中应用广泛；
(2)交联法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成
_________，从而得到三维的交联网架结构；
吸附法
交联法
条件温和
共价键
(3)包埋法是将酶包埋在______________中。
3.应用：固定化酶已被广泛地应用在人们的日常生活、医院、工业等方面。例如，固定化酶在新型青霉素的生产中具有重要作用。
能固化的载体
酶制剂的应用有哪些缺陷？
提示：酶制剂应用的缺陷：(1)通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；(2)溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；(3)反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
想一想
二、固定化细胞技术的应用
1.固定化细胞技术
通过各种方法将______与一定的载体结合，使其仍保持原有的__________，这一过程称为细胞固定化。
细胞
生物活性
2.细胞固定化的方法
(1)吸附法：是制备固定化动物细胞的主要方
法，此法也可制备固定化植物细胞，它既可将植物细胞吸附在______________的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在
___________的外壁上；
泡沫塑料
中空纤维
(2)包埋法：是指将细胞包埋在___________的内部而制成固定化细胞的方法。其中，
________________是应用最广泛的细胞固定化方法，它所使用的载体主要有琼脂、
________________、角叉菜胶、明胶等。
3.固定化细胞技术的优点：可以取代
_____________进行发酵，生产各种物质。
多孔载体
凝胶包埋法
海藻酸钠凝胶
游离的细胞
(1)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×)
(2)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×)
(3)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、交联法和吸附法。(×)
判一判
要点突破 讲练互动
直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
酶的种类 一种或几种 一种 一系列酶
常用载体 无 高岭土、皂土、硅胶、凝胶 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
制作方法 无 化学结合固定化、物理吸附固定化 包埋法固定化
是否需要营养物质 否 否 是
催化反应 单一或多种 单一 一系列
反应底物 各种物质(大分子、小分子) 各种物质(大分子、小分子) 小分子物质
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
缺点 ①对环境条件非常敏感，易失活
②难回收，成本高，影响产品质量 不利于催化一系列的酶促反应 反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降
优点 催化效率高、耗能低、低污染 ①既能与反应物接触，又能与产物分离②可以反复利用 成本低、操作容易
特别提醒
①固定化细胞使用的都是活细胞，因而为了保证其生长、增殖的需要，应该为其提供一定的营养物质。
②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，酶的环境改变小，所以对酶的活性影响最小。
下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述
中，正确的是( )
A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显
B．固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧
C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件
例1
D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物
【思路点拨】 本题主要考查固定化酶和固定化细胞的异同。解答本题关键掌握：
①固定化酶每次只是固定一种酶，而固定化细胞发挥作用的是整个细胞中所有的酶分子。
②固定化酶作为一种有机物需要适宜的温度、pH，但不需要氧气和营养条件。
【解析】 固定化酶耐受性比较好，和溶解氧没有关系；利用固定化酶降解水体中的有机磷农药，不需要提供营养条件；利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类既可以作为反应底物，也可以作为碳源来调节酵母菌的代谢方式。
【答案】 A
1. (2012·邵阳高二检测)下列关于酶和细胞的固定化，叙述不正确的是( )
A．酶分子很小，宜采用包埋法
B．酶分子很小，宜采用化学结合法或物理吸附法固定
C．细胞个大，难被吸附或结合
D．细胞宜采用包埋法固定
变式训练
解析：选A。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定。这是由于细胞相对较大，而酶分子相对很小，个大的细胞难以被吸附或结合，个小的酶容易从包埋材料中漏出。
1.方法
(1)吸附法
①动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。
②将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝
中，或将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。
固定化细胞技术及其应用、优缺点
(2)包埋法
①含义：将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。
②凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方
法，适用于微生物、动物和植物细胞的固定
化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝
胶、角叉菜胶、明胶等。
2.应用
(1)固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发
酵，生产各种物质。
(2)科学家们还成功地用固定化原生质体生产出谷氨酸。
3.点
(1)固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代
谢，可以像游离的细胞一样用于发酵生产。
(2)固定化细胞技术免去了破碎细胞提取酶等步骤，能充分利用细胞内的酶，因而，固定化细胞内酶的活性基本没有损失。
(3)保留了细胞内原有的多酶系统，对于多步催化的连续反应优势就更加明显。
4.缺点
(1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。
(2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。
(3)在好氧性发酵中，限制了溶解氧的传递和输送。
(2012·江苏仪征中学高二检测)下图是酶的几种固定方式示意图，其所采用的固定方法依次是( )
例2
A．吸附法、交联法、包埋法
B．交联法、吸附法、包埋法
C．包埋法、吸附法、交联法
D．包埋法、交联法、吸附法
【解析】 ①图表示酶包埋在细微网格里，应属包埋法；②图表示许多酶分子通过特殊试剂连接起来，成网状结构，应属交联法；③图表示固定在一定的支持物上，可用物理吸附法、离子结合法和共价结合法固定，应属吸附法。
【答案】 D
【探规寻律】 酶和细胞的固定方法和特点
固定对象 酶 细胞
适宜固定法 交联法、吸附法 包埋法
特点 体积小，固定一种酶。包埋法容易丢失 体积大，固定一系列酶。难以化学结合和吸附
发挥作用需要的条件 适宜的温度、pH 适宜的温度、pH、还需要营养物质和氧气
变式训练
2. (2012·南通高二检测)下列关于固定化细胞技术的说法中，正确的是( )
A．吸附法的优点是操作简单，吸附牢固
B．包埋法的优点是操作复杂，条件温和，对细胞无毒性
C．吸附法容易对酶活性产生影响
D．凝胶包埋法常用的凝胶种类有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶和明胶等
解析：选D。固定化细胞的主要方法有吸附法和包埋法。它们各有利弊，吸附法的主要优点是酶活性不受影响，但吸附过程相当复杂，这一过程与微生物细胞的性质、载体的性质以及两者之间的相互作用等有关，吸附力较弱且吸附不牢固，细胞容易脱落。包埋法操作简便，条件温和，对细胞无毒性，适合于生长细胞的固定化。凝胶包埋法常用的凝胶种类有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶和明胶等。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
1.操作流程
固定化酵母菌细胞的制备
2.注意事项
(1)选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单
一。
(2)酵母菌细胞活化时体积会变大，因此活化前应选择体积足够大的容器，防止酵母菌细胞的活化液溢出。
(3)海藻酸钠溶液的配制是固定化酵母菌细胞的关
键，因为如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠，如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数量少，也会影响实验效果。
(4)溶化海藻酸钠时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。
(5)将溶化后的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母菌细胞混合，避免高温杀死酵母菌。
(6)固定化酵母菌细胞时，应将海藻酸钠与酵母菌细胞的混合液用注射器缓慢滴加到饱和硼酸—氯化钙溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。
(7)可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，作为对照。
【问题与探究】
如何检验凝胶珠的质量是否合格？
【提示】 检验凝胶珠的质量是否合格，可以采用以下方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不破
裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成
功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。
三是观察凝胶珠的颜色。如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏
低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
【例题】 下面的流程图示意制备固定化酵母菌细胞的过程，请据图回答：
(1)图中酵母菌活化就是________________状
态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时________________。
(2)影响此实验成败的关键步骤是_________。此步的操作应采用________________。
(3)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞数目________________。
(4)观察凝胶珠的颜色和形状：如果颜色过浅，说明________；如果形成的凝胶珠不是________，说明实验操作失败。
(5)本实验所用的固定化技术是________，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是________。
【解析】 (1)酵母菌在干燥时，处于休眠状
态，需加水活化，否则制成的固定化酵母菌在发酵时酶活性较低且酵母菌增殖缓慢。(2)该实验的关键是海藻酸钠的配置。(3)如果海藻酸钠的浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量过少，影响实验效果。(4)如果制作的凝胶珠颜色过浅呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低。
如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。(5)由于酵母菌细胞个体较大，不易从包埋材料中漏出，故细胞的固定化一般采用包埋法，而固定化酶不宜用此方法。
【答案】 (1)让酵母菌恢复正常生活
体积增大较大(多)
(2)配制海藻酸钠溶液 小火或间断加热
(3)较少
(4)固定的酵母菌细胞数目较少 圆形或椭圆形
(5)包埋法 酶分子很小，容易从包埋材料中漏出(共50张PPT)
第二节 分子生物学技术
学习导航
1.尝试PCR(DNA聚合酶链式反应)技术的基本操作。
(重难点)
2．体验PCR这一常规分子生物学实验方法。(难点)
3．理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。(重点)
新知初探 思维启动
生物转化环节
DNA重组
工程菌
2.原核生物、真核生物的细胞已被用于大批
量生产__________、_________等外源蛋白；植物和动物也可以作为天然的
_____________，用于生产新的或改造过的基因产物。DNA重组技术还大大简化了新药的开发和检测系统。
胰岛素
干扰素
生物反应器
(1)工程菌是指用DNA重组技术的方法使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。(√)
(2)克隆羊“多利”是分子生物学的发展的成果。(×)
判一判
二、PCR技术(聚合酶链式反应)
1.PCR技术的含义
在体外快速扩增_______________或DNA序列(目的DNA片段)的实验技术，又称为聚合酶链式反应。
2.PCR技术的原理
(1)条件：DNA模板、____________、_____、4种脱氧核苷酸。
特定基因
DNA聚合酶
引物
(2)PCR扩增的特点：_______、简便和
________。
(3)进行PCR的先决条件：待扩增的DNA片段___________________要为已知。
(4)引物序列确定的依据是：被扩增区域的3′端边界DNA序列。
快速
灵敏
3′端核苷酸序列
1．在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是什么？
提示：生物体外，利用DNA的热变性原理：94 ℃时DNA的双螺旋结构将解体，双链分开。
想一想
三、PCR扩增的过程
1.物质条件(反应成分)
(1)引物：两种_____________，每种由15～40个核苷酸聚合而成。
(2)反应物：4种______________(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。
(3)DNA聚合酶：常用的DNA聚合酶是从一种嗜热菌中分离得到的______________。
寡核苷酸
脱氧核苷酸
Taq聚合酶
(4)模板DNA：既可来源于动物、植物、微生
物，也可来源于人工合成。
(5)Mg2＋：提供DNA聚合反应的离子条件。
(6)_____________ ：提供反应的溶液体系。
2.PCR扩增过程
变性→退火→延伸
(1)变性：在94 ℃高温下作为模板的双链DNA_________成为单链DNA。
反应缓冲液
解旋
(2)退火：反应体系的温度降至40～60 ℃，使得________与作为模板的单链DNA上特定部位相互配对、结合。
(3)延伸：反应体系的温度回升到72 ℃左右，在单链上4种脱氧核苷酸按照______________的原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的______________。
引物
碱基互补配对
DNA双链
想一想
2．某考古学家在冰中发现了一种已经灭绝的巨型动物的肌肉，采取什么方法可以判断该动物与现今大象的DNA相似？
提示：用PCR技术扩增该动物的DNA，与大象的DNA进行比较。
要点突破 讲练互动
PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较
体内复制 PCR反应
不同点 解旋 在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至94 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶
引物 小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
体内复制 PCR反应
不同点 合成
子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72 ℃左右
特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增
DNA
聚合酶 需要 需要Taq DNA
聚合酶
体内复制 PCR反应
不同点 循环
次数 受生物体自身控制 30多次
温度 体内温和条件 高温(可变)
产物 完整DNA DNA片段
相同点 ①需提供DNA复制的模板
②以四种脱氧核苷酸为原料
③都需要一定的缓冲溶液
④子链延伸的方向都是从5′端到3′端
特别提醒
①DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。
②解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键。
③DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
④在PCR反应中，加入的四种脱氧核苷酸实际上是四种脱氧核苷三磷酸，既是原料，也是能源。
⑤在PCR反应中加入的Mg2＋实际上是Taq聚合酶的激活剂。
(2012·盐城高二检测)PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
例1
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．①②
C．①③ D．②④
【解析】 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为15～40个核苷酸。②PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
【答案】 C
【探规寻律】 细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。
1.有关PCR技术，下列叙述不正确的是( )
A．聚合酶链式反应，是在体外扩增DNA片段的技术
B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C．PCR反应只需在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
变式训练
D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸
解析：选C。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
PCR技术相关知识分析
2. PCR引物
(1)引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
(2)引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR反应失败。
(3)引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
3.PCR扩增的过程
(1)变性：当温度上升到94 ℃时，双链DNA解旋为单链，如下图：
(2)退火：温度下降至40～60 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
(3)延伸：当温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下
图：
4. PCR扩增数目的理论计算
理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2n个DNA。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，
并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段序列呈指数扩增。
近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
例2
(1)加热使DNA双链间的________键完全打开，称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。当温度降低至56 ℃时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的________端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是___________________。
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的________和________，前者由________自动调控，后者则靠________来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。
【解析】 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94 ℃)、退火(40 ℃～60 ℃)、延伸(72 ℃)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′
端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。
【答案】 (1)氢 变性 解旋
(2)两 3′ 从子链的5′端向3′端延伸
(3)温度 酸碱度 PCR自动扩增仪 缓冲液 (4)1/8
互动探究
(1)PCR中碱基错配会引起哪种变异？
(2)假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占多少？
【提示】 (1)基因突变。
(2)50%。
变式训练
2. (2012·信阳高二质检)如图表示PCR扩增的产
物，请分析它是哪次循环的产物( )
A．第一次循环 B．第二次循环
C．第三次循环 D．第四次循环
解析：选A。在PCR反应中以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以，形成的每个子代DNA中只有一种引物。从第二次循环开始，第一次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，形成的DNA分子两端都含有引物。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
1.操作流程
目的DNA片段的体外扩增
2.注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。
(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
(4)EB是一种致癌物，在实验过程中要做好防护工作，如戴塑料膜防护手套；在紫外灯下观察时要戴上专用护眼镜！
【问题与探究】
1.你明白PCR技术原理吗？
【提示】 在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR技术利用了DNA的热变性原理：在94 ℃的高温
下，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA，当温度缓慢降低后，引物与模板的单链DNA的特定部位互补配对，再升高温度后，引物链延
伸，形成互补的DNA双链。
2.你了解PCR反应的条件吗？
【提示】 (1)稳定的缓冲液环境。
(2)DNA模板。
(3)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物。
(4)A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
(5)耐热的DNA聚合酶，一般用Taq聚合酶。
(6)能严格控制温度变化的温控设备。
3.如何判断DNA片段的扩增是否成功？
【提示】 (1)可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。
(2)电泳检测法，可以通过在紫外灯下观察荧光带的多少来评价扩增的效果。
【例题】 下列有关PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术是利用碱基互补配对的原则
B．PCR技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等
C．PCR技术需在体内进行
D．PCR技术经过变性、退火、延伸三个阶段
【解析】 PCR技术是聚合酶链式反应的简
称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。
【答案】 C(共58张PPT)
第二节 植物组织培养技术
学习导航
1.理解植物组织培养的原理。(重点)
2．明确植物组织培养的一般过程。(重难点)
新知初探 思维启动
无菌
离体
愈伤组织
全能性
完整基因组
完整植株
已经分化
愈伤组织
愈伤组织
1．为什么科学家利用胡萝卜的韧皮部细胞就可以培育出完整的胡萝卜植株？
提示：原因是植物的每个细胞都具有全能性。
想一想
二、植物组织培养技术的操作流程(以天竺葵的组织培养为例)
1.准备：实验器材和药品。
2.配制：配制MS基本培养基。分别向MS基本培养基中添加所需的激素，配制诱导愈伤组织形成的培养基、分化芽的培养基、_______的培养基，搅拌均匀，并调节pH。
生根
3.灭菌
4.取材与接种
(1)取天竺葵幼嫩的叶，流水冲净后，吸去表面水分，浸没在质量分数为10%的__________或质量分数为2%的NaClO溶液中5～15 min，用无菌水冲洗4～6次，消毒并切成约0.5 cm2的小
块。
漂白粉
(2)接种于已经配制好的诱导__________形成的培养基上，做好标记放在适宜条件下培养。
5.观察与记录
每天观察___________的生长情况，并记录其变化情况。
6.转接幼苗：愈伤组织→分化芽的培养基→幼芽→_________的培养基→炼苗→移栽。
愈伤组织
外殖体
生根
2．在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作？
提示：避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。
想一想
三、植物激素对植物组织培养的影响
______________________是启动细胞分裂、脱分化、再分化的关键激素。
1.生长素用量比细胞分裂素用量多时，有利于_____________而对芽的形成有抑制作用。
2.生长素用量比细胞分裂素用量少时，有利于__________而抑制根的形成。
3.生长素用量与细胞分裂素用量相当时，则促进_____________的生长。
生长素、细胞分裂素
根的分化
芽的分化
愈伤组织
1．(1)在植物组织培养过程中，一般要添加生长素和细胞分裂素等激素。(√)
(2)当生长素的用量比细胞分裂素用量的比值高时有利于愈伤组织组织的形成。(×)
(3)植物能够进行光合作用，故光照是植物组织培养过程中的必要条件。(×)
(4)植物激素的使用顺序对植物组织培养没有影响。(×)
判一判
四、植物组织培养的应用
1.___________ 优良植物株系。
2.培育农作物_________。
3.保存和运输种质。
4.培育__________植株。
快速繁殖
新品种
无病毒
2．(1)利用植物组织培养技术能培养抗病毒植
株。(×)
(2)单倍体育种利用了植物组织培养技术。(√)
(3)植物组织培养不改变原植物的基因型。(√)
判一判
要点突破 讲练互动
植物组织培养的技术
1.细胞的全能性
(1)概念：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。
(2)基础：生物体的每一个细胞都含有本物种的全套遗传物质，都有发育成完整个体所必需的全套基因。
(3)生物体内细胞没有表现出全能性，是由于基因在特定的时间和空间条件下选择性表达，形成不同的组织和器官的结果。
(4)植物细胞全能性大小的比较：
受精卵＞生殖细胞＞体细胞。
体细胞中：幼嫩组织细胞(芽尖)＞成熟组织细胞。
2.植物细胞全能性实现的条件
(1)离体状态；
(2)提供种类齐全、比例适合的营养物质；
(3)提供激素(细胞分裂素和生长素)；
(4)无菌操作(防止杂菌污染)；
(5)提供其他适宜条件(如温度、酸碱度、光照
等)。
3.植物组织培养的基本过程
特别提醒
植物组织培养中脱分化和再分化的比较：
比较内容 脱分化 再分化
过程 细胞→愈伤组织 愈伤组织→幼苗
特点 排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞 有根、芽
需要条件 无菌、离体；适宜的营养；生长素和细胞分裂素 无菌、离体；适宜的营养；生长素和细胞分裂素、光照
植物细胞表现出全能性的必要条件是
( )
A．导入其他植物细胞的基因
B．将成熟的细胞核移植到去核的卵细胞中
C．用适当浓度的秋水仙素处理
D．脱离母体后，给予适宜的营养和适宜的温度等外界条件
例1
【思路点拨】 本题最关键的是掌握植物细胞表现出全能性的前提条件是离体。
【解析】 植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织发育、分化出新的植物体。
【答案】 D
1.下列实例中能体现细胞全能性的是( )
①用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株
②植物用种子繁殖后代
③用烟草的单个组织培养出了可育的完整植株
A．①② B．①③
C．②③ D．①②③
变式训练
解析：选B。细胞全能性是指已经分化的细胞仍然具有发育成完整植株的潜能。其中①和③都是属于由分化的细胞经过培养形成可育的植株，体现了细胞的全能性。植物的种子是具有胚芽、胚轴、胚根等完整个体雏形的生殖器官，由其发育成后代不能体现细胞的全能性。
植物激素(生长素和细胞分裂素)对实验结果的影响
影响因素 实验结果
植物激素的浓度 根据生长素作用的两重性：低浓度促进生长，高浓度抑制生长，甚至杀死植物
影响因素 实验结果
植物激素用量 生长素＞细胞分裂素 有利于根的分化、抑制芽的形成
生长素＜细胞分裂素 有利于芽的分化、抑制根的形成
生长素≈细胞分裂素 促进愈伤组织的形成
影响因素 实验结果
使用顺序 先生长素，后细胞分裂素 有利于细胞分裂，但细胞不分化
先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化
同时使用 分化频率提高
(2012·南京高二质检)回答下列有关植物组织培养的问题。
(1)用于植物组织培养的植物材料称为________。
(2)组织培养中的细胞，从分化状态转变为未分化状态的过程称为____________。
(3)在再分化阶段所用的培养基中，含有植物激素X和植物激素Y，逐渐改变培养基中这两种植物激素的浓度比，未分化细胞群的变化情况如图所示，据图指出两种激素的不同浓度比与形成芽、根、愈伤组织的关系：
例2
①当植物激素X与植物激素Y的浓度比等于1时，_______________________________________；
②____________________________________；
③____________________________________。
(4)生产上用试管苗保留植物的优良性状，其原因是_____________________________________。
【思路点拨】 本题主要考查植物组织培养的相关知识，解答本题需从以下角度分析：
①了解植物组织培养的一般过程。
②理解植物激素在植物组织培养中的作用。
③明确植物组织培养的作用。
【解析】 (1)用于植物组织培养的材料叫外殖体。
(2)植物组织培养的核心过程是脱分化与再分化，脱分化指由分化状态变为未分化状态，再分化指由未分化状态变为分化状态。
(3)仔细分析所给示意图，可知植物激素X与植物激素Y浓度比为1时，利于愈伤组织的形成，大于1时利于细胞群分化出芽，小于1时利于细胞群分化出根。
(4)植物组织培养是一种无性繁殖技术，利于保持亲本的优良性状。
【答案】 (1)外殖体 (2)脱分化
(3)①未分化细胞群经分裂形成愈伤组织
②当植物激素X与植物激素Y的浓度比大于1时，未分化细胞群分化形成芽
③当植物激素X与植物激素Y的浓度比小于1时，未分化细胞群分化形成根
(4)组织培养形成试管苗的过程属于无性繁殖，后代不发生性状分离
变式训练
2.下列关于影响植物组织培养的因素，说法正确的是( )
A．不同植物组织培养的难易程度不同，同一种植物材料培养的难易程度相同
B．在植物组织培养中，培养基中必须添加植物激素
C．植物激素中生长素和细胞分裂素的作用是互相独立的
D．pH、温度、光照条件等对植物组织培养也特别重要
解析：选D。同一种植物材料随年龄、保存时间的不同，培养的难易程度不同；有些植物组织培养不需要添加植物激素；植物激素中生长素和细胞分裂素的作用是互相影响的。
植物组织培养技术、微生物培养技术和无土栽培技术的比较
植物组织培养 微生物培养 无土栽培
含义 在无菌条件下，将离体的植物体器官或组织接种在适当的培养基上进行培养，最终发育成完整植物体 在无菌条件下，在适宜的营养和环境条件下对微生物的培养 将植物生长发育过程中所需各种矿质元素按一定比例配成营养液，并利用这种营养液栽培植物
植物组织培养 微生物培养 无土栽培
培养基成分 水、矿质元素、蔗糖、维生素、有机添加物和植物激素等 水、无机盐、碳源、氮源等 水、必需矿质元素
特殊操作要求 严格控制无菌操作，在培养过程中要更换培养基，调节细胞分裂素和生长素的比例 严格控制无菌操作，整个培养过程无需更换培养基 适宜的环境条件，基质垫底并固定幼苗，不需要保证无菌条件
(2012·渭河高二检测)右图是植物组织培养的简略表示图。请据图回答：
(1)把组织培养的过程按正确顺序排列________(用字母表示)。
例3
(2)外殖体发育成一个完整个体需经过_______和_______两个过程。
(3)若B中为胡萝卜根尖细胞，则培养成的新植株的叶片的颜色是________，这说明根尖细胞_______________________________。
(4)从理论上讲，植物细胞有形成再生植株的可能性，这是______________的表现。
【解析】 本题考查植物组织培养技术。(1)取离体的植物组织或器官置于适宜的条件下，诱导形成愈伤组织、丛芽和完整植株，正确的组织培养顺序是BDCA。(2)外殖体发育成一个完整的个体需经过脱分化和再分化两个重要的过程。(3)由胡萝卜的根尖细胞培养成的完整植株的叶片含有绿色，因为在植物的根尖细胞中携带着一套来自受精卵的完整基因组，含有控制叶片绿色性状的基因。(4)植物组织培养依据的是植物细胞的全能性。
【答案】 (1)BDCA
(2)脱分化 再分化
(3)绿色 含有控制叶片绿色性状的基因
(4)细胞全能性
变式训练
3.用于植物组织培养的培养液和用于无土栽培的营养液相比，以下说法不正确的是( )
A．都必须含植物必需的矿质元素
B．都必须含有少量的有机物
C．不都需要含有植物激素
D．浓度都必须小于细胞液的浓度
解析：选B。无土栽培的幼苗一开始就能进行光合作用，并且自身能够合成植物激素，所以营养液中不需要加入有机物和激素；而植物组织培养过程中，在分化形成芽之前，细胞不能进行光合作用，代谢需要的有机物只能从培养基中获得，所以用于植物组织培养的培养液必须含有少量的有机物和适量植物激素。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
1.制备MS固体培养基(过程见教材P22～23)
2.外殖体消毒
天竺葵的组织培养
植物的茎、叶部分多暴露于空气中，栽培时受泥土、肥料及杂菌的污染，消毒前要经自来水较长时间清洗。取天竺葵的细嫩的茎洗净放在质量分数为10%的漂白粉或质量分数为2%的NaClO溶液中5～15 min，取出用无菌水冲洗4～6次，切块备用。
3.接种
接种时必须在近火焰处打开容器的瓶口，并使瓶倾斜，以免空气中的微生物落入瓶中，整个接种工作都应始终在近火焰处进行，接种完成后，立刻盖好瓶口。
4.培养
(1)愈伤组织的培养
首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭，不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长得更快。2周以后，由于培养基中的营养成分已接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。
(2)愈伤组织的继代培养
进行继代培养所用的培养基和培养愈伤组织所用的培养基相同。在严格的无菌条件下(接种箱内)将愈伤组织连同原来的外殖体，一起移到新的培养基上。愈伤组织的继代培养，一代为20 d。
如果延长培养时间，培养基中的营养物质会减少，外殖体也会分泌一些有毒物质，造成自身中毒。20 d以后，可以根据愈伤组织的大小，决定是继续进行继代培养，还是进行试管苗培养。如果愈伤组织长到直径为1～1.5 cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需要进行第二代继代培养。在愈伤组织进行继代培养期间，可以将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后，颜色可以转为绿色。
(3)试管苗的培养
当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的培养，试管苗的培养分为生芽培养和生根培养。培养一株完整的试管苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养，如果顺序颠
倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。注意，试管苗应该进行见光培养。
5.移栽
试管苗一般在高湿、弱光、恒温下异养生长，出瓶后一定要保温、保湿。试管苗光合作用能力低，在移栽前给予较强光照闭瓶炼苗，以促进小苗向自养转化。珍珠岩为固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合做栽培的基质。
6.栽培
将幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直到开花。
【问题与探究】
1.在植物组织培养的过程中，为什么要进行一系列的消毒、消毒，并且要求无菌操作？
【提示】 植物组织培养的主要目的是快速繁殖、培养无病毒植株，因此，必须保证培养材料、培养基、培养用具完全无菌，并且无菌操作。
其原因是：a.培养基上的细菌等微生物比植物具有更强的新陈代谢能力，利用植物组织培养的培养基迅速的大量繁殖，它们比植物细胞生长得更快。b.细菌等微生物产生毒素，使培养基的植物细胞很快中毒死亡。因此在植物组织培养过程中要进行一系列消毒灭菌，并且无菌操作。
2.接种3～4 d观察外殖体生长情况，据统计有部分外殖体被污染，分析外殖体被污染的原因？
【提示】 外殖体被污染的原因：①培养材料的取材没有很好地加以选择，老的材料比幼嫩的材料带菌多，田间的材料比温室的生长材料带菌多；②材料消毒不彻底，植物组织只能进行表面消毒，对材料内部所带的细菌、霉菌等杂菌往往难以对付，可在培养基中添加抗生素解决；
③人为污染，如使用未消毒工具或呼吸排出细
菌，手接触材料或器皿边缘，使用过的工作器具未消毒而再继续使用，造成交叉污染，接种室空气污染，使真菌孢子在培养基上繁殖。
3.接种时要注意哪些问题？
【提示】 接种时注意事项：①每接种一块外殖体前，镊子需放入体积分数为75%的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种。注意，沾有酒精的镊子要等到酒精挥发完后，再放到酒精灯火焰上灼烧；②外殖体放入培养基时，必须放平。
每瓶放置外殖体的数量，应该根据锥形瓶的大小确定，一般放置胡萝卜3～4块，菊的茎或叶6～8
块。注意外殖体在培养基中分布均匀，也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分；③插入时应注意方向，不要倒插。茎尖、茎段等基部插入培养基，利于吸收水分和养分；④接种时的酒精灯火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种的速度要快，接种时严防接种箱内着火；⑤接种后应及时盖好瓶盖，作好标记，写明材料名称和接种日期。
【例题】 下图是水稻的花药通过无菌操作，培养花粉产生植株的两种途径的示意图。请据图回答下列问题：
(1)C过程指________，B指________。
(2)这两种途径之间没有绝对的界限，主要取决于_________________________________。
(3)配制培养基时加琼脂的目的是____________________________________。
(4)组织培养要求无菌操作的原因是___________________________________。
(5)要促进花粉细胞分裂和生长，培养基中应有________和________两类植物激素。
【解析】 (1)花药离体培养过程再分化形成丛芽后需要诱导生根。(2)图示两种途径的主要区别在于所使用培养基中激素的种类及浓度比不同。(3)培养基中加入琼脂可制成固体培养基。(4)由于微生物会在营养丰富的培养基上快速繁殖，与离体培养的植物组织进行竞争，故培养过程中应“无菌”操作。(5)植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的应用对于外殖体脱分化、再分化至关重要。
【答案】 (1)诱导生根 生根
(2)培养基中激素的种类及其浓度配比
(3)使培养基呈固体状态，有利于外殖体的生长
(4)如不无菌操作，微生物会在培养基上快速繁
殖，与离体培养的植物组织竞争
(5)细胞分裂素 生长素(共18张PPT)
绪论 实验开启生物科学王国的大门
绪论 实验开启生物科学王国的大门
学习导航
1．简述生物科学是21世纪最活跃学科的依
据。(重点)
2．了解生物科学实验的重要性。
新知初探 思维启动
细胞学说
生物进化论
人类基因组计划
高水平科学论文
刊物
影响因子
获诺贝尔奖
刊物水平通常根据刊物的“影响因子”来判
断，你认为“影响因子”是什么？
提示：刊物的“影响因子”是指在全世界范围内对这种刊物所发表的论文的引用情况，在一定程度上代表了某一学科在国际科学界的活跃程度，反映了这一学科的重要性和它在现代科学发展中的地位。
想一想
二、实验开启生物科学王国的大门
实验名称 有关内容
细胞学说创立 ①1665年，________在《显微图谱》中首次使用“细胞”的概念
②19世纪30年代，________和
______，分别独立提出“细胞学说”
胡克
施莱登
施旺
实验名称 有关内容
DNA分子结构之谜 1953年，________和________确立了DNA双螺旋结构模型
稻谷培育新纪元 20世纪70年代初，_______利用其助手发现的自然不育株(雄性不育)作为杂交水稻的育种材料，提出了水稻杂种优势利用的观点
哺乳动物克隆 1997年2月23日，nature杂志宣布，由英国科学家们采用的哺乳动物________克隆出的绵羊“多利”已经问世
沃森
克里克
袁隆平
体细胞
(1)细胞学说揭示了植物细胞与动物细胞的区别。(×)
(2)DNA双螺旋结构中碱基排列顺序代表遗传信
息。(√)
(3)克隆羊的问世说明动物细胞具有全能性。(×)
(4)袁隆平利用自然不育株培育杂交水稻的原理是基因突变。(×)
判一判
要点突破 讲练互动
生物科学取得的成就
1.各时期取得的成就
经历时期 成就
16～18世纪 解剖学、生理学、分类学、胚胎学等一些分支学科的先后建立和发展
19世纪 生物科学全面发展，在这期间创立了细胞学说、生物进化论和遗传理论，它们被誉为现代生物科学的三大基石
经历时期 成就
20世纪 生物科学的面貌发生了巨大的变革，从静态的、定性描述性的学科向动态的、定量实验性的学科转化
21世纪 人类基因组计划的完成标志着生物科学新时代的开始。同时，在生物科学的宏观层面，现代生态学已发展成为以人类活动为研究主体的、多层次的综合性学科
2.生物科学是21世纪最活跃的学科之一
在21世纪从事生物科学工作的人数，及发表的有价值的高水平科学论文数在总数上占有绝对的优势。正是由于有大量科学家涌入，发表了大量有价值的科学论文，从而使生物学科无可争议地成为了热门学科。不断出现的重大突破必然使生物科学成为科学的前沿领域，因此，可以预计在未来一段时间内，生物科学仍将是整个自然科学领域中最活跃的学科。
【知识拓展】 科学实验有两种含义：一是指探索性实验，即探索自然规律与创造发明或发现新东西的实验，这类实验往往是前人或他人从未做过或还未完成的研究工作所进行的实验；二是指人们为了学习、掌握或教授他人已有科学技术知识所进行的实验，如学校中安排的实验课中的实验等。
实际上两类实验是没有严格界限的，因为有时重复他人的实验，也可能会发现新问题，从而通过解决新问题而实现科技创新。但是探索性实验的创新目的明确，因此科技创新主要由这类实验获得。
下列各项说法中不正确的是( )
A．16～18世纪，生物科学的一些分支学科先后建立和发展
B．19世纪是生物科学全面发展的世纪，在此期间创立了现代生物科学的三大基石
C．20世纪生物科学发生了巨大变革，DNA分子双螺旋结构的建立标志着生物科学新时代的开始
D．21世纪生物科学是最活跃的学科之一
例
【解析】 20世纪生物科学发生了巨大变革，人类基因组计划的完成则标志着生物科学新时代的开始。
【答案】 D
以下生物科学成果不属于20世纪以后的是
( )
A．动物解剖学
B．证明DNA是遗传物质
C．提出DNA双螺旋结构模型
D．转基因技术的发展
变式训练
解析：选A。解剖学、生理学、分类学、胚胎学等一些分支学科是在16～18世纪先后建立和发展的。(共43张PPT)
第二节 测定发酵食品中的特定成分
学习导航
1.学习测定亚硝酸盐的方法。(重点)
2．尝试设计实验，探究影响发酵食品中亚硝酸盐含量的因素。(难点)
3．检测果汁中维生素C含量。(难点)
新知初探 思维启动
水
工业用盐
(3)分布：广泛存在于自然环境中，在食物中都可以检测出一定量的亚硝酸盐。
(4)对人体的影响：亚硝酸盐进入血液后能将正常携带氧的低铁血红蛋白氧化为
_____________，使其失去携带氧气的能力，导致组织缺氧，出现中毒现象。人中毒剂量为_____________，致死剂量为_____。食品是人体摄入亚硝酸盐的主要来源。
高铁血红蛋白
300～500mg
3g
2.亚硝酸盐含量的测定
(1)测定原理：与显色剂(N-1-萘基乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液等体积混合)反应生成有色化合物，通过比色可以粗略地检测亚硝酸盐的含量。
(2)基本步骤：配制试剂→样品处理→配制系列亚硝酸钠标准溶液→样品测定→记录亚硝酸钠含量。
1．泡菜制作过程中应定期测定亚硝酸盐的含
量，原因是什么？
提示：发酵不同时期亚硝酸盐的含量会发生变
化，及时检测是为了把握取食的最佳时机。
想一想
二、测定发酵食品中有益物质的含量
1.维生素C的有关知识
(1)地位：维生素C又称____________，是人体不可缺少的一种物质。
(2)功能：促进人体的生长发育，增强人体对疾病的抵抗能力等。
(3)缺乏症：__________。
(4)来源：必须从_________中摄取。
(5)分布：广泛存在于新鲜的_____和______中。
抗坏血酸
坏血病
食物
水果
蔬菜
2.测定维生素C含量的原理
维生素C是一种强还原剂，它能将__________ 2， 6-二氯靛酚溶液还原成________。
蓝色的
无色
2．维生素C是人体不可缺少的物质，缺乏会患坏血病，是否饮食中维生素C含量越多越好呢？
提示：人体内的任何物质的含量都有一个最适
量，过多或过少对人体都是不利的。维生素C是无毒的营养素，但每天摄入量超过8 g会有害，症状包括：恶心、腹部痉挛、腹泻、红血球破坏、骨骼矿物质代谢增强、血浆胆固醇升高，并可能对大剂量维生素C形成依赖。
想一想
要点突破 讲练互动
测定亚硝酸盐含量
1.实验原理
在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺反应生成紫红色物质。亚硝酸盐溶液的浓度不同，呈现的颜色深浅不一：溶液浓度高，颜色深，浓度低，颜色浅。
2.亚硝酸钠标准显色液的配制方法和样品测定
(1)亚硝酸钠标准显色液的配制过程
①取6支比色管，编号1～6号，分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL的亚硝酸钠标准使用液，并设置一支比色管作空白对照，编号7号。
②在各比色管中分别加入2.0 mL的对氨基苯磺酸溶液，混匀静置3 min，再分别加入2.0 mL的N?1?萘基乙二胺溶液，添加蒸馏水使各比色管总体积为50 mL。
③得到不同颜色的亚硝酸钠标准显色液。
(2)待测样品的测定：配制待测样品，与标准显色液比色，记录对应亚硝酸钠含量。
3.几种药品的作用
(1)氯化铵缓冲液：保持弱碱性环境。
(2)氢氧化钠：中和过多的乳酸，制造弱碱环境。
(3)硫酸锌溶液：吸附样品滤液中的杂质，使滤液透明澄清，以便后续的显色反应。
特别提醒
我国食品卫生标准规定的亚硝酸盐含量标准：
肉制品 酱腌菜 婴儿奶粉
亚硝酸盐的残
留量(mg/kg) <30 <20 <2
关于测定亚硝酸盐含量的操作，错误的是
( )
A．质量浓度为10 g/L的对氨基苯磺酸溶液呈酸性
B．对氨基苯磺酸溶液和N?1?萘基乙二胺溶液应避光保存
C．质量浓度为10 μg/mL的亚硝酸钠溶液应保持弱碱性环境
D．显色剂制备时，N?1?萘基乙二胺溶液和对氨基苯磺酸以2∶1的体积比混合
例1
【解析】 对氨基苯磺酸溶液和N-1-萘基乙二胺溶液都呈酸性，应避光密闭保存；亚硝酸钠标准液配制过程中应加入NH4Cl缓冲液，保持弱碱性环境以免形成亚硝酸挥发；显色剂制备
时，N-1-萘基乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液应等体积混合。
【答案】 D
1.在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺发生反应形成( )
A．血红色物质 B．棕色物质
C．紫红色物质 D．桃红色物质
解析：选C。在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺发生反应形成紫红色物质。
变式训练
泡菜发酵可分为三个阶段：
1.发酵初期：以不产酸的大肠杆菌和酵母菌活动为主，同时还有一部分硝酸还原菌活动。该时期消耗了氧气，产生了厌氧环境，乳酸细菌才开始活动。乳酸细菌和乳酸的量都比较少，由于硝酸还原菌的活动，亚硝酸盐含量有所增加。
泡菜腌制过程中乳酸细菌、乳酸和亚硝酸盐的含量变化
2.发酵中期：由于乳酸细菌大量繁殖，产生了大量乳酸，此时只有乳酸细菌活动强烈，其他细菌活动受到抑制。此期乳酸细菌数量达到高峰，乳酸的量继续积累。由于硝酸还原菌受抑制，同时形成的亚硝酸盐又被分解。
3.发酵后期：由于乳酸的积累，酸度继续增长，乳酸细菌的活动也受到抑制。乳酸细菌数量下
降，硝酸还原菌完全抑制。因亚硝酸盐含量下
降，所以乳酸细菌、乳酸和亚硝酸盐在整个发酵过程中的含量变化趋势为：
(2012·南京高二质检)某同学在泡菜腌制过程中每3～4天测一次亚硝酸盐的含量，其结果如表：
泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化(mg/kg)
例2
(1)本实验所用测定亚硝酸盐含量的方法是________。
(2)在图中绘出1号坛泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化图。
(3)结合曲线和表中数据分析亚硝酸盐含量变化的原因。
(4)三个泡菜坛亚硝酸盐含量为何有差别？原因何在？在泡菜腌制过程中应如何减少亚硝酸盐的含量？
【思路点拨】 本题主要考查亚硝酸盐含量测定的相关知识，解答本题应注意以下几点：
①理解亚硝酸盐含量测定的原理。
②明确泡菜制作时亚硝酸盐的含量变化。
③正确分析亚硝酸盐含量变化的原因。
【解析】 本实验的原理是在弱酸条件下，亚硝酸盐与显色剂发生反应，然后与已知浓度的标准显色液进行比较，估算出亚硝酸盐的含量。此外，本题解答时应注意分析各种数据的变化趋势，而不是着眼于某一个具体数值。亚硝酸盐的含量变化与腌制泡菜中的杂菌数量有密切的关系，杂菌越多，亚硝酸盐含量越高。
【答案】 (1)比色法
(2)
(3)由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于杂种细菌的繁殖(包括一些硝酸盐还原菌)，这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸菌大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。
(4)三个泡菜坛中亚硝酸盐含量最少的为2号坛，最多的为3号坛。3号坛亚硝酸盐含量多的原因可能是泡菜腌制的过程中被污染。在泡菜腌制过程中注意腌制时间，控制好温度和食盐用量。
变式训练
2.制泡菜过程中亚硝酸盐的含量变化( )
A．先减少后增加 B．先增加后减少
C．逐渐增加 D．逐渐减少
解析：选B。泡菜腌制过程中，由于坛内环境中硝酸还原菌的繁殖，促进硝酸盐还原为亚硝酸盐，但随腌制时间延长，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，抑制硝酸还原菌繁殖，使亚硝酸盐含量逐渐下降。
实验探究 专项突破
【操作与实践】
1.操作步骤如下：
根据个人爱好，选择白菜、萝卜、黄瓜、豆角等作为制作材料，经修整、洗涤、晾晒、切成条状或片状。
制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
2.按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐
水，将盐水煮沸冷却。
3.将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛内，装至半坛时，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满，再徐徐注入配置好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
4.在坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸细菌发酵所需的无氧环境。
5.配制连续浓度变化的标准显色液。
6.处理样品处理液，并加入对氨基苯磺酸溶液和N-1-萘基乙二胺溶液，比色对应亚硝酸盐的含量。
【问题与探究】
1.为什么泡菜坛内有时会长一层白膜？你认为这层白膜是怎么形成的？
【提示】 形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
2.测定食品中亚硝酸盐含量的原理是怎样的？
【提示】 在弱酸的条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺反应形成紫红色染
料。将显色反应的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
3.测定亚硝酸盐含量时有哪些注意事项？
【提示】 测定亚硝酸盐含量的操作中，要注意做好配制溶液，制备标准显色液，制备样品处理液、比色。并注意每次取样要用洗净的筷子、小匙，专人专用，专人清洗。取样后迅速封坛，防止泡菜被污染。
维生素C含量的测定
【操作与实践】
1.将泡菜用水果刀切块，用研钵研磨，然后进行过滤得滤液。同时用维生素C片配制一定浓度的维生素C溶液。
2.分别用针筒吸取1 mL 2，6-二氯靛酚溶液(蓝色)，注入洁净的试管1、2中。
3.向试管1中逐滴加入受检泡菜滤液，一旦发现蓝色变成无色立即停止，记录加入的泡菜滤液的体积。
4.向2号试管中逐滴加入一定浓度的维生素C溶
液，待溶液刚好由蓝色变成无色时停止滴加，记录加入的维生素C溶液的体积。
5.比较使1 mL 2，6-二氯靛酚溶液还原所需要的泡菜物质。
【问题与探究】
4.2号试管中加入一定浓度的维生素C溶液的目的是什么？
【提示】 作为对照，以便测定泡菜中所含的维生素C。
【例题】 下列关于食品的检测做法，正确的是( )
A．日常的食品中含亚硝酸盐很少，没有必要对食品进行检测
B．日常的食品中只有亚硝酸盐会对人体构成伤害，对食品进行检测时只要检测亚硝酸盐的含量即可
C．泡菜在研制过程中，是经过严格灭菌发酵得来的，只会产生乳酸这种有益物质，不用检测可大胆食用
D．对食品检测时，不仅要检测亚硝酸盐的含量和砷、铅等物质的含量，还要检测黄曲霉、大肠杆菌菌群、食品中的致病菌等物质的含量
【解析】 亚硝酸盐在我们的日常食品中广泛存在，对很多食品都需要检测；泡菜的制备过程中，硝酸盐可能会被还原成亚硝酸盐，需要对食品进行检测；对人体健康构成危害的不仅仅是亚硝酸盐，重金属、微生物、病原体等都可能对人体构成危害，亚硝酸盐不是惟一的检测指标。
【答案】 D
