生物人教版（2019）选择性必修3 3.2基因工程的基本操作程序（共65张ppt）

第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
转基因抗虫棉
苏云金杆菌
抗虫基因
棉花
观看视频，思考：
1.重组DNA技术（基因工程）需要哪些基本工具？
2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
限制酶
DNA连接酶
载体
苏云金杆菌
获取抗虫基因
抗虫基因与载体连接
导入棉花细胞
检测与鉴定
转基因抗虫棉
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
基因工程培育抗虫棉的简要流程
基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
2
基因表达载体的构建
3
将目的基因导入受体细胞
4
目的基因的检测与鉴定
1
目的基因的筛选与获取
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
思考: 培育转基因抗虫棉，转入棉花的是什么基因？
这个基因从哪里来？作用是什么？
苏云金杆菌
目的基因
Bt 抗虫蛋白
Bt 基因
（主要是指编码蛋白质的基因）
产生
表达
表达
思考：如何筛选合适的目的基因（Bt基因）呢？
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
苏云金杆菌
从相关的已知结构
和功能清晰的基因中筛选
1
目的基因的筛选与获取
阅读书本，思考转基因抗虫棉抗虫的机制是什么？
破坏鳞翅目昆虫的
消化系统杀死棉铃虫
1
目的基因的筛选与获取
苏云金杆菌
（目的基因）
Bt 抗虫蛋白
Bt 基因
产生
表达
相关信息：（书本P77）
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
筛选目的基因的技术手段：
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
1
目的基因的筛选与获取
PCR获取和扩增目的基因
人工合成
方法
目的基因的获取
从基因文库中获取
（书P82）
特点：基因比较小，核苷酸序列已知；无需模板；合成周期短，正确性高等。
特点：具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对标本的纯度要求低等。
思考：明确了目的基因后，如何获取目的基因（Bt基因）呢？
人工合成
1
目的基因的筛选与获取
PCR技术
全称：聚合酶链式反应
穆里斯等人于1985年发明，1993年获诺贝尔化学奖。
生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，短时间内大量扩增目的基因。
利用PCR获取和扩增目的基因
观看视频，思考：
1. DNA复制的原理是什么？
2. DNA体内复制需要哪些组分？这些组分的作用分别是什么？
温故知新
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA半保留复制
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸
合成子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
表.DNA复制所需的基本条件
体内DNA复制
解旋酶
DNA
聚合酶
引物
利用PCR获取和扩增目的基因
体内DNA复制
PCR技术
模板DNA
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
解旋酶
RNA引物
2种DNA引物
90-95℃
耐高温的DNA聚合酶
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
PCR仪
【相关信息】书本P77
用于PCR引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链DNA，引物长度通常为20-30个核苷酸。
体外DNA复制——PCR基本组分
利用PCR获取和扩增目的基因
引物
TaqDNA聚合酶
钱嘉韵（中国台湾）
1973年从黄石公园热泉中水生嗜热菌（ Thermus Aquaticus ） 中分离出耐高温TaqDNA聚合酶
美国黄石国家公园
水生嗜热菌
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献
书本P86
利用PCR获取和扩增目的基因
体外DNA复制——PCR基本组分
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液
5ul
20mmol/L 的4种脱氧核苷酸的等量混合液
1ul
20umol/L 的引物I
2.5ul
20umol/L 的引物II
2.5ul
H2O
28-33ul
1-5U/uL 的Taq DNA聚合酶
1-2U
模板DNA
5-10ul
总体积
50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
【相关信息】书本P77
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。
书本P84
利用PCR获取和扩增目的基因
体外DNA复制——PCR基本组分
体外DNA复制——PCR的基本过程
观看视频，思考PCR的基本过程包括哪些步骤？
利用PCR获取和扩增目的基因
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
目的基因
5＇
3＇
含有目的基因的DNA片段
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
高温变性
95
50
72
℃
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
低温复性
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
95
50
72
℃
中温延伸
3＇
5＇
5＇
3＇
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
高温变性
95
50
72
℃
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
低温复性
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
95
50
72
℃
中温延伸
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
体外DNA复制——PCR的基本过程
利用PCR获取和扩增目的基因
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
利用PCR获取和扩增目的基因
2n
2n
2n-2n
2n+1-2
2n-1
思考：
1. 经过n次循环，DNA分子数？
2. 目的基因数（双链等长的DNA分子数）？
3. 非目标DNA数？
4. 共消耗的引物数量？
5. 两种引物各消耗的数量？
6.PCR扩增产物如何鉴定？
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
7.电泳鉴定的结果是几条条带？该片段大小为？
一条条带，该片段大小约为750bp
基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
2
基因表达载体的构建
3
将目的基因导入受体细胞
4
目的基因的检测与鉴定
新冠病毒核酸检测
咽拭子采样
检测是否有新冠病毒RNA
新冠病毒RNA的量太少无法检测出来
需要扩增后检测
PCR只能扩增双链DNA
将新冠病毒的RNA通过逆转录后形成cDNA
PCR扩增逆转录后的cDNA
检测
拓展应用

资料：RT-PCR 就是反转录 PCR，是PCR的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 RNA 链被反转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。新型冠状病毒为单链RNA病毒，故采用该方法。
2
基因表达载体的构建
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。
书P79 思维拓展
PCR
RT-PCR
（Reverse Transcription）
思考：用RT-PCR技术获取目的基因所需要的酶主要有？
逆转录酶（反转录酶）、
耐高温的DNA聚合酶
利用PCR获取和扩增目的基因
思考：1.用PCR技术获得了大量的Bt基因（目的基因），能直接导入受体细胞吗？
思考：2.将Bt基因送入受体细胞的载体需要具备什么条件？
载体
质粒
噬菌体
动植物病毒等
有复制原点
有多个限制酶切割位点
有标记基因
图中的pBR322质粒具备载体的必要条件吗？载体还需要具有哪些结构？
载体的必要条件：
有复制原点
有多个限制酶切割位点
有标记基因
有启动子
有终止子
思考：3.启动子和终止子的作用是什么？
思考：4.构建基因表达载体的目的是什么？
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
使目的基因能够表达和发挥作用。
插入基因
目的基因
终止转录
终止子
RNA聚合酶识别和结合的部位
启动子
DNA复制起点
复制原点
抗生素
抗性基因
标记基因，便于重组DNA分子的筛选
构建基因表达载体
（核心工作）
思考：5.如何构建基因表达载体？
例、
(1)除四环素抗性基因和Bt 基因外，作为表达载体，该质粒至少还应该具有________________等调控元件；PstⅠ等的识别序列及切割位点应位于____________片段内，以确保Bt 基因随Ti质粒进入棉花细胞后能插入到棉花细胞中的染色体DNA上。(2)为保证Bt 基因与Ti质粒的正常连接，应选用________酶和MseⅠ酶切割外源DNA，并将Ti质粒上的序列“GAATTC”改造为________________________。
GAATTAATTC
启动子、终止子
T-DNA
PstⅠ
农杆菌转化法
例、某科研小组利用基因工程技术将某抗虫基因转入棉花成功培育出抗虫棉，该技术所用的质粒与含抗虫基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示（不同限制性内切核酸酶的识别序列和酶切位点如下表所示）。请分析并回答下列问题：
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}限制性内切核酸酶名称
识别的碱基序列和酶切位点
BamHⅠ
G↓GATCC
BclⅠ
T↓GATCA
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅢ
A↓AGCTT
(1)利用PCR技术扩增抗虫基因时，一个基因连续扩增4次，共需要______个引物，设计引物序列的主要依据是_____________________________________。
30
抗虫基因两端的部分核苷酸序列
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
目的基因
5＇
3＇
含有目的基因的DNA片段
第三轮
2n+1-2
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}循环数
共消耗的引物数量
1
2
3
4
设计特定的引物
扩增特定的DNA片段
3＇
5＇
5＇
3＇
3＇
5＇
5＇
3＇
第一轮
第二轮
2
6
14
30
例、某科研小组利用基因工程技术将某抗虫基因转入棉花成功培育出抗虫棉，该技术所用的质粒与含抗虫基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示（不同限制性内切核酸酶的识别序列和酶切位点如下表所示）。请分析并回答下列问题：
(2)图2质粒的作用是________________________，质粒中没有标注出来的基本结构是__________________。
将基因送入受体细胞?
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}限制性内切核酸酶名称
识别的碱基序列和酶切位点
BamHⅠ
G↓GATCC
BclⅠ
T↓GATCA
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅢ
A↓AGCTT
复制原点
例、某科研小组利用基因工程技术将某抗虫基因转入棉花成功培育出抗虫棉，该技术所用的质粒与含抗虫基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示（不同限制性内切核酸酶的识别序列和酶切位点如下表所示）。请分析并回答下列问题：
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}限制性内切核酸酶名称
识别的碱基序列和酶切位点
BamHⅠ
G↓GATCC
BclⅠ
T↓GATCA
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅢ
A↓AGCTT
(3)某同学认为，在构建抗虫棉基因表达载体的过程中，可采用限制酶HindⅢ切割质粒和含目的基因的DNA片段。请对该同学的观点做简要评价。________________________
该观点不合理，目的基因需要插入到质粒的启动子和终止子之间才能成功表达，质粒上存在两个限制酶HindⅢ的酶切位点，其中一个的酶切位点不能使目的基因成功表达
例、某科研小组利用基因工程技术将某抗虫基因转入棉花成功培育出抗虫棉，该技术所用的质粒与含抗虫基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示（不同限制性内切核酸酶的识别序列和酶切位点如下表所示）。请分析并回答下列问题：
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}限制性内切核酸酶名称
识别的碱基序列和酶切位点
BamHⅠ
G↓GATCC
BclⅠ
T↓GATCA
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅢ
A↓AGCTT
(4)用图中的目的基因和质粒构建抗虫棉基因表达载体时，科研人员分别选用限制酶__________切割质粒、选用限制酶___________________切割含目的基因的DNA片段。
BamHⅠ
BamHⅠ和Sau3AⅠ（或Sau3AⅠ）
思考：6.若目的基因的两端没有限制酶的酶切位点，如何获取大量目的基因？
设计引物序列时，科研人员在两种引物的______端分别添加____________________________，目的是____________________________________________________________。
5’
保证扩增的目的基因片段有酶切位点，以便与质粒顺利连接
两种限制酶的识别序列
(5)研究发现，含目的基因的DNA片段完全酶切后，反应管中有______种DNA片段，得到含目的基因的DNA片段末端碱基序列是______________________________。
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}限制性内切核酸酶名称
识别的碱基序列和酶切位点
BamHⅠ
G↓GATCC
BclⅠ
T↓GATCA
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅢ
A↓AGCTT
?? GATCC-和-CTAG??
3???
思考：8.目的基因的两端以及被切割的质粒均产生了相同的黏性末端，在构建基因表达载体时，可以形成哪些连接产物？
思考：7.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?
同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
GGATCC
CCTAGG
…
…
GATC
CTAG
…
…
目的基因
GATCC
G

CTAG
G
G
A
T
C
C
C
C
A
G
G
T
G
A
T
C
C
G
G
C
C
A
G
T
1
1'
2
2'
1和1'连接
2和2'连接
自身环化
相互连接
1和2连接， 1 '和2'连接
1和2'连接，1 '和2连接
正向
反向
质粒自身环化；
含目的基因的外源DNA自身环化；
质粒和含目的基因的外源DNA反向连接；
质粒和含目的基因的外源DNA正向连接
思考：9.使用两种限制酶同时处理（能产生不同的黏性末端）质粒、含抗虫基因的DNA的优点是什么？
可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接（保证目的基因与质粒的正向连接）。
(6)图中抗生素抗性基因的作用是_____________________________________________。
(7)将上述切开的质粒与目的基因混合，加入_____________酶连接后，利用花粉管通道法导入受体细胞，得到的受体细胞的类型（对两种抗生素X和Y表现出抗性R或非抗性S）包含_______________（不考虑基因突变）。①XRYR ②XRYS ③XSYR ④XSYS
作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选
DNA连接
①②④
普通质粒
重组质粒
目的基因自身环化结构
XSYS
XRYR
XRYS
基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
2
基因表达载体的构建
3
将目的基因导入受体细胞
4
目的基因的检测与鉴定
思考：1.如何将含有Bt基因的表达载体导入棉花细胞？
例、
(1)上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内所用的方法是________________。
(2)从棉株细胞到抗虫棉幼苗的培养还需要_______________技术，包含的两个过程是____________和____________。
农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
①
②
植物组织培养
脱分化 再分化
3
将目的基因导入受体细胞
思考：
2.农杆菌自然条件下侵染什么植物？为什么？
3.通过农杆菌将目的基因导入植物细胞的关键操作是什么？
将目的基因导入受体细胞
双子叶植物和裸子植物
资料：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，当双子叶植物和裸子植物受伤时，伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T?DNA内
Bt基因插入了棉花细胞的染色体DNA上
思考：
4.农杆菌将Bt基因导入棉花细胞，为什么使抗虫性状稳定维持并表达？
将目的基因导入受体细胞
①
②
(3)过程②中，应优先选用棉花受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_________________________________________________________________。
叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞
将目的基因导入受体细胞
思考：5.除了农杆菌转化法外，还有什么方法将Bt基因导入棉花细胞？
(4)我国独创的花粉管通道法更是一种十分简便经济的方法。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加_________________________（填“目的基因”或“含目的基因的表达载体”），使目的基因借助花粉管通道进入________________________。
(5)与农杆菌直接转化棉株细胞相比，花粉管通道法具有的优点有__________________
含目的基因的表达载体
受体细胞（或植物细胞）
花粉
卵细胞
精子
花粉管
将目的基因导入受体细胞
操作简单、直接，不需要经过植物组织培养，转化成功后可直接获得种子
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
——转化
将目的基因导入受体细胞
花粉管通道法
农杆菌转化法
体细胞
受精卵
显微注射法
Ca2+转化法
例、
(1)若限制酶MboⅠ的识别序列和切点是-↓GATC-，限制酶BamHⅠ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，那么在过程①中，应用限制酶______________________________________切割含抗虫基因的DNA片段，用限制酶__________切割质粒。
(2)为筛选出含有重组Ti质粒的土壤农杆菌菌落，需采用含有不同抗生素的培养基进行筛选。符合要求的菌落在只含氨苄青霉素的培养基中的生长情况为___________（填生长或不生长）。
MboⅠ（或MboⅠ和BamHⅠ）
BamHⅠ
不生长
思考：6.要把重组质粒导入农杆菌，首先应如何处理农杆菌？又如何筛选呢？
思考：7.如何筛选导入重组Ti质粒的农杆菌？
1
2
3
4
5
6
7
8
9
添加氨苄青霉素的培养基
√
√
√
平板影印培养法
添加四环素的培养基
资料：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出相应的目的菌株。
4
目的基因的检测与鉴定
思考：8.Bt基因一定进入了棉花细胞并维持稳定吗？如何检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因？
目的基因的检测与鉴定
检测方法：PCR
思考：9.Bt基因一定能够进行表达吗？
如何检测Bt基因是否转录出了mRNA？翻译出了Bt抗虫蛋白？
检测方法：抗原—抗体杂交技术
检测方法：PCR
检测原理：抗原、抗体的特异性结合
思考：10.棉花一定产生了抗虫的性状吗？如何检测棉花是否产生了抗虫的性状？
抗虫接种实验
转基因抗虫棉
普通种植棉
转基因生物
检测方法
观察指标
抗虫植物
害虫吞食
害虫死亡
抗病毒(菌)植物
病毒(菌)感染
未侵染上病斑
抗盐植物
盐水浇灌
正常生长
抗除草剂植物
喷洒除草剂
正常生长
获取目的基因产物的
转基因生物
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
目的基因的检测与鉴定
(3)检测Bt基因是否插入到棉花细胞染色体DNA上，需要通过______________方法检测，检测抗虫基因是否转录可以用_________等方法。
(1)目的基因进入受体细胞后是否稳定维持和表达其遗传特性，应用___________________的方法，可以检测转基因抗虫棉幼叶中的Bt毒蛋白及其含量，以此来检测_______________________________。
目的基因的检测与鉴定
(4)鉴定抗虫棉是否培育成功，现取若干长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，对照组应设置为___________________________。
接种棉铃虫给普通植株
(2)“杀虫基因”表达产生的Bt抗虫蛋白被分解为多肽后与棉铃虫肠上皮细胞的特异性受体结合导致细胞膜穿孔，破坏棉铃虫的消化系统来杀死棉铃虫。若牲畜误食抗虫棉肠道无明显受损，可能原因是____________________________________________________。
牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体
Bt基因是否表达及表达程度
PCR
抗原－抗体杂交
PCR
思考：11.判断以下目的基因的检测方法和鉴定水平
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
还有其他的方法吗？
例、科研人员提取转基因抗虫棉甲、乙以及非转基因棉丙的基因组DNA，分别用限制酶EcoRI完全酶切，得到的产物和抗虫基因一起进行电泳，并将电泳结果转印到尼龙膜上，再利用带放射性标记的DNA探针与尼龙膜上变性的DNA分子进行杂交，洗去未结合的探针后，进行放射性自显影，结果如右图所示。下列说法错误的是（ ）
A．DNA探针应为带放射性标记的抗虫基因B．甲、乙植株的基因组中均插入了抗虫基因C．乙植株的细胞内有可能插入了两个抗虫基因D．相同位置上的杂交带对应的DNA片段的核苷酸序列相同
D
目的基因的检测与鉴定
不一定相同
目的基因的检测与鉴定
检测目的基因是否插入转基因生物的DNA上
1、检测方法：
DNA分子杂交技术
2、检测原理：
碱基互补配对原则
3、检测过程：
……TATCCATGAATTCGGCATAC……
转基因生物的基因组DNA
目的基因
……GTACTTAAGCCG……
放射性标记
……ATAGGTACTTAAGCCGTATG……
基因探针
目的基因片段
杂交带
基因探针
拓展应用
检测目的基因是否转录出了mRNA
1、检测方法：
分子杂交技术
2、检测原理：
碱基互补配对原则
3、检测过程：
……CCAUGAAUUCGGCAU……
转基因生物的mRNA
……GTACTTAAGCCG……
放射性标记
……ACAAUUGCCGUAACU……
基因探针
目的基因的mRNA
杂交带
目的基因
基因探针
目的基因的检测与鉴定
拓展应用
检测Bt基因是否插入棉花的DNA上
检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
检测Bt基因是否转录出了mRNA
个体生物学水平的鉴定
分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
思考：12.与诱变育种和杂交育种相比，你认为利用基因工程技术培育的抗虫棉植株，具有突出的优点有？
克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物性状等
拓展延伸
降低害虫种群中抗性基因频率的增长速率
思考：13.随着转基因抗虫棉的大面积推广，棉铃虫会逐渐对其产生抗性，生产上常将获得的转基因抗虫棉与普通棉花混合播种，你知道目的是什么吗？
拓展延伸
思考：14.对于棉铃虫逐渐产生抗性的问题，如何解决这一问题？谈谈你的想法。
比如，利用两个机理不同的抗虫基因构建融合基因，培育出双价转基因抗虫棉
资料：单价抗虫棉细胞内可合成新型抗虫蛋白，专一性地破坏鳞翅目害虫的消化道并导致其死亡，而对害虫天敌无害；双价抗虫棉能同时产生两种不同机理杀虫蛋白，不仅具有单价抗虫棉的特性，而且可控制昆虫消化酶使其厌食，加速其死亡。这两种杀虫蛋白具有功能互补性和协同增效性，对控制棉铃虫抗性发展可起到重要作用。
例、
我国科研人员用两个机理不同的抗虫基因（CryIA和Cpti）构建融合基因表达载体，导入棉花细胞培育出双价转基因抗虫棉。自主知识产权抗虫棉的推广在提高经济和环境效益的同时，也保护了中国棉花产业的安全。
基因表达载体中融合基因应位于________________之间
启动子与终止子
拓展延伸
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
从基因文库中获取
人工合成
PCR
基因表达载体的组成及作用
使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
基因工程的核心
意义
目的
获取方法
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
花粉管通道法、农杆菌转化法
显微注射法
Ca2+转化法（感受态细胞法）
方法
方法
方法
分子水平：检测DNA、mRNA、蛋白质
个体水平
常用方法
包括
步骤
用限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段
DNA连接酶连接形成重组DNA分子
基因工程的基本操作程序概念图
感谢聆听！