生物人教版（2019）选择性必修3 1.2.2微生物的选择培养与计数（共45张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版（2019）选择性必修3 1.2.2微生物的选择培养与计数（共45张ppt） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 9.7MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-08-10 19:55:22 | ||
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文档简介
(共45张PPT)
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
1.2微生物的培养技术及应用
高压蒸汽灭菌
液体培养基
二 微生物的选择培养与计数
教学目标
1. 阐明微生物选择培养的原理。
2. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
（一）选择培养基
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
举例
2.实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（一）选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的
培养基，叫做选择培养基。
类型 条件 分离得到的菌种
（1）改变培养条件
（2）添加某种化学物质
（3）营养缺陷
70～80℃的高温
水生栖热菌
加入青霉素
酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
不加碳源
不加氮源
自养型微生物
固氮菌
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
见P18页培养基配方
设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，
判断依据是_________________________________；
该类培养基的主要用途为_____________________；
2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基，
目的是为了获得_____________________；
3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________；
培养基一的碳源为________，氮源为________；
培养基二的碳源为________，氮源为________。
培养基一
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
固体
添加了凝固剂琼脂，
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
讨论：
1.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）
A. 较多的氮源物质 B. 较多的碳源物质
C. 青霉素类药物 D. 高浓度食盐
C
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是（ ）
A. CO2和N2 B. 葡萄糖和N2
C. CO2和尿素 D. 葡萄糖和尿素
D
对土样充分稀释后，将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即稀释涂布平板法。
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法:是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
（二）微生物的选择培养
①梯度 稀释
方法：稀释涂布平板法
铲取土样，将样品装入纸袋中
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
1ⅹ105
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
A
B
B
（二）微生物的选择培养
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。
注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
②涂布平板
方法：稀释涂布平板法
1ⅹ107
C
D
E
F
（二）微生物的选择培养
稀释涂布平板法实验操作
恒温培养箱
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
细菌一般稀释倍104、105、106
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
③菌落培养
方法：稀释涂布平板法
（二）微生物的选择培养
1.两种纯化方法的比较
核心归纳
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
能否用 于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
显微镜直接计数法
间接计数法
直接计数法
（三）微生物的选择培养
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
间接计数法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
A
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
间接计数法
计数原则:
B
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
1.选择多少个菌落的平板进行计数？
2.每个稀释浓度能否只取一个平板，为什么？
3统计的菌落数往往比活菌数少？为什么？
4.你认为成功的关键在于什么？
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
间接计数法
C
如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
公式进行计算。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
例1.两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
一.微生物的选择培养和技术
血细胞计数板--------真核细胞的计数
细菌计数板-------对细菌（原核细胞）
血细胞计数板和细菌计数板有没有何别？
显微镜直接计数法
血细胞计数板和细菌计数板
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
原理
它们的区别就是计数室的高度不同，血细胞计数板计数室的高度是0.1 mm 。
故计算是：
血细胞计数板
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
显微镜直接计数法（计数板计数法）
原理
酵母菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
×稀释倍数
1×10-4
细菌计数板计数室的高度是0.02 mm。
故细菌计数板计数细菌的计算是：
细菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
2×10-5
×稀释倍数
0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL
细菌计数板
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
显微镜直接计数法（计数板计数法）
原理
③一般情况下，计数所得种群数量，比实际值大还是小？为什么？
会比实际要大。因为在计数所得的数据包含了死菌和活菌。
如何克服以上难题？
区分死菌和活菌。可采用台盼蓝对酵母菌进行染色。能被染成蓝色的则为死菌，不能被染色的则是活菌。在此条件下，计数酵母菌时，只需计数不被染色的酵母菌。
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
6.对稀释涂布平板法和显微镜直接计数法进行比较
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、_____________ 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的 数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
血细胞计数板
或细菌计数板
菌落
1.(2021·沂源县第二中学高二期中)下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是
A.实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
B.分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基
C.利用显微镜进行直接计数时，可使用普通的载玻片完成计数
D.接种土壤微生物稀释液时，平板划线法通过连续划线的操作使微生
物均匀分布
典题应用
及时反馈 知识落实
√
2.下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的
能力
√
（1）实验目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
（2）实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
二.探究 实践
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
①提供无机盐；
②调节pH。
①培养基的制备
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
②土壤取样
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A 取样地点要求：
B 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
③样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
B
A
C
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30-300的平板进行计算。
思考2:
③样品的稀释与涂布平板
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
③样品的稀释与涂布平板
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
思考：
1.如何判断选择培养基是否具有选择作用？
2.如何判断培养基是否被污染？
需要将菌液涂布在
牛肉膏蛋白胨基本培养基上
将空白培养基和接种培养
基同时培养
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
④微生物的培养与观察
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A
B
C
一般来说，在相同的培养条件下
，同种微生物表现出稳定的菌落
特征，如形状、大小和颜色等。
说出以下现象对应的结果分析。
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数木
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
⑤结果分析与评价
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
B
3.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后
不会使酚红指示剂变红
典题应用
及时反馈 知识落实
√
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
二.探究 实践
5.进一
步探究
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
鉴别培养基
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,
用以鉴别不同种类的微生物的培养基。
思考： 1.如何对尿素分解菌进行鉴定？
氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断
在培养基中加入酚红指示剂
结果：
酚红指示剂变红，说明是尿素分解菌
脲酶阴性
脲酶阳性
若为固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越 。
强
名称 主要用途 特征性变化
伊红-亚甲蓝 琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 出现带金属光泽的深紫色菌落
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 纤维素被分解后出现透明圈
其他鉴别培养基实例：
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加
入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复
合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列
问题。
练习与应用（P20）
二、拓展应用
（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
练习与应用（P20）
（2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（3）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
课题小结
一、概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
练习与应用（P20）
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
练习与应用（P20）
二、拓展应用
1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
练习与应用（P20）
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
1.2微生物的培养技术及应用
高压蒸汽灭菌
液体培养基
二 微生物的选择培养与计数
教学目标
1. 阐明微生物选择培养的原理。
2. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
（一）选择培养基
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
举例
2.实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（一）选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的
培养基，叫做选择培养基。
类型 条件 分离得到的菌种
（1）改变培养条件
（2）添加某种化学物质
（3）营养缺陷
70～80℃的高温
水生栖热菌
加入青霉素
酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
不加碳源
不加氮源
自养型微生物
固氮菌
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
见P18页培养基配方
设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，
判断依据是_________________________________；
该类培养基的主要用途为_____________________；
2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基，
目的是为了获得_____________________；
3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________；
培养基一的碳源为________，氮源为________；
培养基二的碳源为________，氮源为________。
培养基一
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
固体
添加了凝固剂琼脂，
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
讨论：
1.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）
A. 较多的氮源物质 B. 较多的碳源物质
C. 青霉素类药物 D. 高浓度食盐
C
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是（ ）
A. CO2和N2 B. 葡萄糖和N2
C. CO2和尿素 D. 葡萄糖和尿素
D
对土样充分稀释后，将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即稀释涂布平板法。
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法:是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
（二）微生物的选择培养
①梯度 稀释
方法：稀释涂布平板法
铲取土样，将样品装入纸袋中
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
1ⅹ105
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
A
B
B
（二）微生物的选择培养
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。
注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
②涂布平板
方法：稀释涂布平板法
1ⅹ107
C
D
E
F
（二）微生物的选择培养
稀释涂布平板法实验操作
恒温培养箱
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
细菌一般稀释倍104、105、106
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
③菌落培养
方法：稀释涂布平板法
（二）微生物的选择培养
1.两种纯化方法的比较
核心归纳
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
能否用 于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
显微镜直接计数法
间接计数法
直接计数法
（三）微生物的选择培养
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
间接计数法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
A
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
间接计数法
计数原则:
B
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
1.选择多少个菌落的平板进行计数？
2.每个稀释浓度能否只取一个平板，为什么？
3统计的菌落数往往比活菌数少？为什么？
4.你认为成功的关键在于什么？
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
间接计数法
C
如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
公式进行计算。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
例1.两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
一.微生物的选择培养和技术
血细胞计数板--------真核细胞的计数
细菌计数板-------对细菌（原核细胞）
血细胞计数板和细菌计数板有没有何别？
显微镜直接计数法
血细胞计数板和细菌计数板
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
原理
它们的区别就是计数室的高度不同，血细胞计数板计数室的高度是0.1 mm 。
故计算是：
血细胞计数板
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
显微镜直接计数法（计数板计数法）
原理
酵母菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
×稀释倍数
1×10-4
细菌计数板计数室的高度是0.02 mm。
故细菌计数板计数细菌的计算是：
细菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
2×10-5
×稀释倍数
0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL
细菌计数板
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
显微镜直接计数法（计数板计数法）
原理
③一般情况下，计数所得种群数量，比实际值大还是小？为什么？
会比实际要大。因为在计数所得的数据包含了死菌和活菌。
如何克服以上难题？
区分死菌和活菌。可采用台盼蓝对酵母菌进行染色。能被染成蓝色的则为死菌，不能被染色的则是活菌。在此条件下，计数酵母菌时，只需计数不被染色的酵母菌。
方法2：显微镜直接计数法
一.微生物的选择培养和技术
2.微生物的选择培养
直接计数法
6.对稀释涂布平板法和显微镜直接计数法进行比较
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、_____________ 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的 数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
血细胞计数板
或细菌计数板
菌落
1.(2021·沂源县第二中学高二期中)下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是
A.实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
B.分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基
C.利用显微镜进行直接计数时，可使用普通的载玻片完成计数
D.接种土壤微生物稀释液时，平板划线法通过连续划线的操作使微生
物均匀分布
典题应用
及时反馈 知识落实
√
2.下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的
能力
√
（1）实验目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
（2）实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
二.探究 实践
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
①提供无机盐；
②调节pH。
①培养基的制备
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
②土壤取样
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A 取样地点要求：
B 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
③样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
B
A
C
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30-300的平板进行计算。
思考2:
③样品的稀释与涂布平板
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
③样品的稀释与涂布平板
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
思考：
1.如何判断选择培养基是否具有选择作用？
2.如何判断培养基是否被污染？
需要将菌液涂布在
牛肉膏蛋白胨基本培养基上
将空白培养基和接种培养
基同时培养
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
④微生物的培养与观察
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A
B
C
一般来说，在相同的培养条件下
，同种微生物表现出稳定的菌落
特征，如形状、大小和颜色等。
说出以下现象对应的结果分析。
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数木
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
⑤结果分析与评价
（3）实验步骤
二.探究 实践
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
B
3.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后
不会使酚红指示剂变红
典题应用
及时反馈 知识落实
√
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
二.探究 实践
5.进一
步探究
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
鉴别培养基
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,
用以鉴别不同种类的微生物的培养基。
思考： 1.如何对尿素分解菌进行鉴定？
氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断
在培养基中加入酚红指示剂
结果：
酚红指示剂变红，说明是尿素分解菌
脲酶阴性
脲酶阳性
若为固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越 。
强
名称 主要用途 特征性变化
伊红-亚甲蓝 琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 出现带金属光泽的深紫色菌落
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 纤维素被分解后出现透明圈
其他鉴别培养基实例：
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加
入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复
合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列
问题。
练习与应用（P20）
二、拓展应用
（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
练习与应用（P20）
（2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（3）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
课题小结
一、概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
练习与应用（P20）
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
练习与应用（P20）
二、拓展应用
1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
练习与应用（P20）