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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
动物细胞工程的发展历程
希普:首例胚胎
移植成功
哈里森:首创动物组织体外
培养法
张明觉:发现哺乳动物精
子获能现象
格登、童第周:体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒:创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯:成功分离和培养小
鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥:获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
动物细胞培养
动物细胞融合
动物细胞核移植
动物细胞培养是其他动物细胞工程技术的基础。
动物细胞工程常用的技术
第1课时 动物细胞培养
动物细胞培养需要哪些基本条件?
动物细胞培养的基本操作过程是什么?
怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险?
指动物机体中取出相关的组织,将它分散成 ,然后,放在 ,让这些细胞 的技术。
动物细胞培养
细胞增殖(有丝分裂)
胚胎或幼龄动物的细胞
获得细胞或者细胞产物
①原理:
②培养对象:
③目的:
④作用:
人造皮肤的构建,动物分泌蛋白的生产等,是动物细胞工程的基础
因为这些组织或细胞的生命力旺盛,分化程度低,分裂能力强,容易培养
单个细胞
适宜的培养基中
生长和繁殖
营养容易供应,代谢废物容易排出
1、概念:
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质,满足细胞对未知营养成分的需求。
培养基的构成:合成培养基 + 血清等天然成分
一般使用液体培养基,也称为培养液
2.培养条件:
动物细胞培养
①适宜的温度:哺乳动物细胞培养的温度多以___________为宜;
②适宜的pH:多数动物细胞生存的适宜pH为________ ;
③适宜的渗透压:维持细胞正常的形态和功能。
①培养液、培养用具:灭菌处理;
②无菌操作;③适量添加抗生素
定期更换培养液,以便清除代谢物。
36.5±0.5℃
7.2-7.4
2.培养条件:
动物细胞培养
2.培养条件:
动物细胞培养
维持培养液的pH
95%空气 + 5%CO2 的CO2 培养箱
仪器:CO2培养箱
容器:松盖培养瓶
O2:细胞代谢所必需
动物细胞培养
【例1】动物细胞体外培养时,通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。下图表示血清对正常细胞和癌细胞培养的影响。下列叙述正确的是( )
A.补充血清后,正常细胞与癌细胞的增殖速率相同
B.动物细胞培养过程中,是否添加血清均可
C.培养基中补充血清对正常细胞的促进作用更明显
D.培养基中是否补充血清对正常细胞培养影响不大
C
带着以下问题阅读教材:
1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢?可用什么方法?
2.体外培养动物细胞有哪些类型?
3.什么是细胞贴壁?什么是接触抑制?
4.什么是原代培养和传代培养?
5.为什么要进行分瓶培养?怎么处理?
6.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处?
动物细胞培养
3.培养过程:
取动物组织
用机械法或用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理,避免限制生长增值
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数)
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
细胞悬液
原代培养
分瓶培养
①细胞贴壁:某些细胞需要贴附于某些基质表
面才能增殖,这类细胞往往贴附
在培养瓶的瓶壁上
②接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接
触时,细胞停止分裂增殖的现象。
③原代培养:分瓶前的细胞培养,指动物组织
经处理后的初次培养
④传代培养:分瓶后的细胞培养。
加培养液
放入培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞,用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液,分瓶培养
①收集细胞
动物细胞培养
注意:相关酶可使细胞裂解,应注意用量和时间
3.培养过程:
圆球形细胞刚开始
铺展贴壁生长(100×)
培养的动物细胞贴壁生长
并进行有丝分裂(100×)
细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制(100×)
动物细胞培养
接触抑制现象
思考:
“细胞增殖到互相接触的时候,糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖,出现接触抑制的现象”试结合上述解释,举例说明哪种细胞无接触抑制现象,并阐述原因
单层细胞
多层细胞
动物细胞培养
癌细胞;癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
传代培养一般培养有限代次后,细胞就会死亡,如果细胞不死,就意味着细胞的遗传物质发生了改变,即具有异倍体核型。
目前用于冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的细胞,以保持细胞正常的二倍体核型。
细胞株
从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞,能传到40-50代,其遗传物质没有发生变化。
细胞系
传到40-50代后,有部分细胞遗传物质发生了变化,具有癌细胞的特点,失去接触抑制,可能在培养条件下无限制的传代下去。
动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基物理性质
培养基特有成分
过程
培养结果
培养目的
相同点
教材P45思考与讨论
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂,不涉及减数分裂;
2.均需无菌操作,需要适宜的温度、pH等条件
动物细胞培养
脱分化-再分化
原代培养-传代培养
1.幼龄动物的细胞更容易培养
2.比较异同:
动物细胞培养
【典例1】如图所示为动物细胞培养的基本过程,下列关于甲、乙、丙、丁四个操作过程的叙述,正确的是( )
C
A.甲过程可选取动物个体的任何组织细胞
B.乙过程可用纤维素酶和果胶酶处理细胞
C.丙过程所用培养液中需添加动物血清
D.丁过程中的细胞因接触抑制而大量死亡
动物细胞培养
【变式训练1】在进行动物细胞培养时,需要( )
A.用胃蛋白酶处理以获得单细胞悬液
B.充入5%CO2以刺激细胞正常呼吸
C.加入经高压蒸汽灭菌的血清以提供营养
D.定期更换培养液以清除代谢产物
D
动物细胞培养
①干细胞的概念:
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。(必1P121)
在一定条件下,干细胞可以分化成其他类型的细胞。
包括 和 等。
胚胎干细胞
成体干细胞
再生医学、药物安全与有效性检测;导致肿瘤的风险
③干细胞的分类:
④应用及局限性:
4.干细胞的培养应用:
②干细胞的分布:
干细胞存在于___________、_______和_______等多种组织和器官中;
早期胚胎
骨髓
脐带血
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞,并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
胚胎干细胞
分布
特点
应用实例
在体外分化成心肌细胞、
神经元细胞和造血干细胞等
ES细胞
局限性
必须从胚胎中获取 ,涉及伦理问题;因而限制了在医学上的应用。
动物细胞培养
4.干细胞的培养应用:
骨髓以外的血液
造血干细胞(返现最早研究最多,骨髓、外周血和脐带血中)
神经干细胞(神经系统中)
精原干细胞(睾丸中,分化成精原细胞)
成体组织或器官内
具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力。与组织器官的发育再生和修复有关,应用广泛。
成体干细胞
分布
举例
特点
应用实例
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
造血干细胞→
神经干细胞→
治疗细胞损伤造成的疾病
动物细胞培养
4.干细胞的培养应用:
通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞
①将特定基因或特定蛋白导入细胞
(成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞)
诱导多能干细胞
概念
制备方法(相关信息)
应用
优点
iPS
细胞
②用小分子化合物诱导形成。
①诱导过程无须破坏胚胎;
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞,将它移植回病人体内后,理论上可以避免免疫排斥反应。
可治疗镰状细胞贫血症;
在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
动物细胞培养
4.干细胞的培养应用:
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
(类似脱分化的过程)
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
动物细胞培养
4.干细胞的培养应用:
诱导多能干细胞
(iPS细胞)
多种体细胞
定向诱导分化
体外诱导小鼠成纤维细胞
临床治疗人类疾病如:
白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
课堂小结
动物细胞培养
动物细胞培养
练习与应用
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1)培养环境中需要O2,不需要CO2 。( )
(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。( )
(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清( )
(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖( )
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
×
√
×
×
A
动物细胞培养
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(1)由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间,因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑,如果要将这些细胞用于紧急情况,应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样,有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库,可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞,这样不仅可以节省时间、成本,还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
动物细胞培养
练习与应用
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟,该技术可能会有哪些应用?又可能带来哪些问题?
该技术可能被用于治疗不孕症;获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究;获得生殖细胞进行转基因操作,再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如,如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子,两者受精可能培育出“单亲”婴儿;有的人还可能有目的地选择iPS细胞,从而“设计”婴儿。