生物人教版(2019)选择性必修3 3.2基因工程的基本操作程序（共55张ppt）

(共55张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
教学目标
1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。
3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
基因工程
新课导入
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
基因工程的基本操作
2.基因表达载体的构建
1.目的基因的筛选与获取
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
Bt基因
Ti质粒
重组DNA分子
将目的基因插入染色体DNA中
基因工程的基本操作
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
终止子：终止转录
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
基因工程的基本操作
　 科学工作者分离得到了某原核生物基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。
非编码区
非编码区
编码区
信使RNA
基因的一条链
Ａ
Ｂ
Ｃ
原核细胞的基因结构
基因工程的基本操作
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
编码区：
间隔的、不连续的
有外显子、内含子之分
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
数量关系：外显子=内含子 + 1
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
基因工程的基本操作
真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？
成熟信使RNA
对应基因的一条链
编码区
非编码区
非编码区
Ａ
Ｂ
Ｃ
思考：从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。
胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素
基因工程的基本操作
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
（2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
（1）非编码序列：
包括非编码区和内含子
思考2：
【目的基因】在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
目的基因的筛选与获取
目的基因
获取目的基因的方法
1.人工合成目的基因。
2.通过构建基因文库来获取目的基因。
3.常用 PCR 特异性地快速扩增目的基因。
基因文库
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
基因组文库
部分基因文库：主要是cDNA（互补DNA）文库
目的基因的筛选与获取
基因组文库
cDNA文库
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
基因组文库和部分基因文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
目的基因的筛选与获取
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR扩增仪
PCR是_______________的缩写，是一项根据___________
________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术；
PCR技术：
聚合酶链式反应
DNA半保
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
留复制
原理
操作环境
目的
优点：
目的基因的筛选与获取
PCR的条件
①DNA（含目的基因）模板。
②分别与模板DNA相结合的两种引物。
③A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
④耐高温的DNA聚合酶。
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
⑥能严格控制温度的温控设备。
一小段（20-30个）能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
脱氧核苷三磷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
耐高温的Taq DNA聚合酶
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
检测方法
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物？
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物
细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
引物结合在模板链的3’端
目的基因的筛选与获取
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR反应过程
目的基因的筛选与获取
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
目的基因的筛选与获取
PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
7.PCR产物的鉴定
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
【三点提醒】
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
脱氧核苷三磷酸
dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？
如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。
目的基因的筛选与获取
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制
起始位点 引物3'端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（Taq酶） 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 高温解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
基因表达载体的构建
①目的基因：
②启动子：
③终止子：
④标记基因：
控制特定性状或表达特定产物。
位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始。
位于基因的末端，终止转录。
检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。
⑤复制原点：DNA聚合酶结合位点。
基因表达载体的构建
基因表达载体的组成
基因表达载体的构建
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
【区分两组概念】
位于基因上
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
本身不转录
决定氨基酸
不决定氨基酸
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
基因表达载体的构建
过程
基因表达载体的构建
请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
基因表达载体的构建
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能有何弊端？
能
①质粒、目的基因发生自身环化；
②质粒与目的基因会发生反向连接。
基因表达载体的构建
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
①载体与表达载体区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
②工具酶：限制酶、DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
基因表达载体的构建
基因表达载体构建
基因表达载体的组成
启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因＋复制原点
基因表达载体构建的过程
一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶把两者连接。
目的基因的筛选与获取
利用PCR技术获取和扩增
cDNA文库
从基因文库中获取
基因组文库
课堂小结
巩固练习
1．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是 (　 　)
A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D．二者遵循的碱基互补配对原则相同
B
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　)
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
3.2 基因工程的基本操作程序（课时2）
教学目标
1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2.针对人类生产或生活中的某- -需求， 选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
基因工程
知识回顾
针对不同的受体细胞，选用不同的方法。
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞（大肠杆菌、土壤农杆菌等）
农杆菌转化法（最多）
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因导入受体细胞方法
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法：
我国科学家独创
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
操作方式①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
操作方式②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
受体细胞为？
受精卵
将目的基因导入受体细胞
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
①农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上；
c.利用农杆菌进行转化的方法：
可转移的DNA
（2）农杆菌转化法（常用）
细菌质粒的透射电镜图（100000×，经后期着色处理）
T-DNA的T是什么意思？为何要把目的基因接在T-DNA中？
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法（常用）
据图可知，目的基因发生了几次剪切和拼接？重组Ti质粒跨越了几层细胞膜？
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法（常用）
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
将目的基因导入受体细胞
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受
体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细
胞。
2. 显微注射法
显微注射法示意图
普通鼠与生长速度加快的转基因鼠
将目的基因导入动物细胞时，常使用显微注射法。1982年，科学家将含有生长激素基因的重组DNA片段，通过显微操作仪注射到受精卵内还未融合的雄性细胞核中，体外培养一段时间后再将胚胎移植到雌性小鼠子宫内，获得了成功转入目的基因的体型大、生长快的"超级小鼠"。
将目的基因导入受体细胞
3.目的基因导入微生物细胞
——Ca2+处理法
（1）受体细胞：
常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
（2）一般过程：
一般先用Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
再将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞比较
将目的基因导入受体细胞
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？
是否可以确定目的基因一定能够进行表达？
是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
2.检测内容及方法:
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
1.目的:
目的基因的检测与鉴定
（1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
2.提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
单链DNA或RNA片断，带有某种标记，能与目标DNA或RNA的一条链发生碱基互补配对。
目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增和分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
2.提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
目的基因的检测与鉴定
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
原理？
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原
抗原抗体的特异性结合
转基因生物
怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。
目的基因的检测与鉴定
2.个体水平的检测
转基因生物 检测方法 观察指标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
目的基因的检测与鉴定
（1）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞 （　　 ）
（2）Ti质粒上的T -DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起 （　 　）
（3）可以将目的基因直接导入受体细胞 （　 　）
（4）检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术 （　 　）
（5）用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则 （　　 ）
（6）基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定 （　 　）
1.基础检测
巩固练习
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是( ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要 DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
巩固练习