生物人教版(2019)选择性必修3 3.2.1 基因工程的基本操作程序（共40张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版(2019)选择性必修3 3.2.1 基因工程的基本操作程序（共40张ppt） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 45.3MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-10-04 07:29:11 | ||
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文档简介
(共40张PPT)
3.2.1 基因工程的基本操作程序
2022-10-04
显微注射技术
2022-10-04
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，，让棉花也能产生产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
2022-10-04
一、目的基因的筛选和获取
目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。
目的基因
“杀虫基因”—Bt抗虫蛋白基因
思考：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
2022-10-04
1.筛选合适的目的基因
（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。
（2）实例：苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。
2022-10-04
2.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR：是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
（2）DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替）
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
2022-10-04
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。体内复制的引物为RNA单链。
（3）DNA体外复制（PCR）的条件
模板：
原料：
酶：
引物：
缓冲液：
2022-10-04
温度控制：
含Mg2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
一小段DNA单链，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸，一般用dNTP
提取的DNA
高温变性→低温复性→适温延申；三个温度周期性变化
2022-10-04
（4）PCR扩增的过程
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
4.PCR的过程
目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
（1）变性
①温度：
②具体变化：
上升到90℃以上
双链DNA解旋为单链
（2）复性
①温度：_____________
②具体变化：
下降到50℃左右
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
（3）延伸
①温度：_____________
②具体变化：
上升到72℃左右
4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
（4）重复循环
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
思考：
1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？
2.引物是什么？在复性过程中引物结合到模板链的哪一端？
3.延伸过程是否需要ATP供能？
4.PCR为什么需要引物？
氢键；不需要酶，需要90℃以上的高温
短单链核酸3’端
不需要；由dNTP水解供能
DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链
（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）
2022-10-04
拓展1：3.获取目的基因的其他方法
（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
基因组文库
②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
反（逆）转录酶
单链互补DNA
DNA聚合酶
双链DNA片段
与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
cDNA文库
真核细胞的cDNA的获取
编码区
非编码区
非编码区
DNA聚合酶
剪接有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
2022-10-04
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
2022-10-04
2022-10-04
（2）利用化学方法人工合成
①需要仪器：DNA合成仪。
②适用目的基因类型：要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知；
③不需要模板。
2022-10-04
作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
二、基因表达载体的构建（核心）
1 构建表达载体的目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
2022-10-04
2.基因表达载体的结构
启动子
（1）启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达。
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
2022-10-04
启动子
（2）终止子： 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游（尾端），标志着转录的停止。
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
（3）标记基因
①作用：便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
（4）目的基因：如Bt基因。
（5）复制原点
作用：使能完成自主复制。
2022-10-04
质粒
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
限制酶
获取目的基因
连接酶
重组DNA分子
载体（质粒）
含有目的基因的DNA片段
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割
带有黏性末端（或平末端）的切口
带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
3.基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
同一种限制酶切割获得的目的基因和载体混合后，加DNA连接酶会出现的两两连接的方式有：
自连
片段间两两连接
目的基因自身环化
载体自身环化
目的基因与目的基因连接
载体与载体连接
目的基因与载体连接
2022-10-04
拓展2：
故实际应用中往往选择两种不同的限制酶分别切割，减少自连情况出现；还应用标记基因对重组DNA进行筛选。
2022-10-04
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
2022-10-04
（2）农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
②特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
2022-10-04
③实验思路（过程）：
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
④具体转化方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
2022-10-04
⑤农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
（1）受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
3.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
1.目的
①检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
②检查转基因生物是否培育成功；
2.目的基因的检测与鉴定方法
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR、分子杂交技术等
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状）
抗性测定、个体性状测定等
四、目的基因的检测与鉴定
思考：
如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA？
①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测；
②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测；
拓展3：分子杂交技术
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA。
拓展4：抗原-抗体杂交技术
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质
酶联反应：固学案P16：7题
思考：
1.在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？
2.在酶联反应中，测量指标为什么？
抗原
显色反应，看颜色深浅
拓展5：个体生物学水平的鉴定的具体做法
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未侵染上病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
3.目的基因的检测与鉴定方法的顺序
基因工程的基本操作流程图
练习与应用
1：√ × ×
2：D
拓展应用
1：提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。
例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2022-10-04
2022-10-04
1）答案：ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
2）答案：不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
3）提示：维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。
关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。
3.2.1 基因工程的基本操作程序
2022-10-04
显微注射技术
2022-10-04
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，，让棉花也能产生产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
2022-10-04
一、目的基因的筛选和获取
目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。
目的基因
“杀虫基因”—Bt抗虫蛋白基因
思考：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
2022-10-04
1.筛选合适的目的基因
（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。
（2）实例：苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。
2022-10-04
2.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR：是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
（2）DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替）
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
2022-10-04
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。体内复制的引物为RNA单链。
（3）DNA体外复制（PCR）的条件
模板：
原料：
酶：
引物：
缓冲液：
2022-10-04
温度控制：
含Mg2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
一小段DNA单链，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸，一般用dNTP
提取的DNA
高温变性→低温复性→适温延申；三个温度周期性变化
2022-10-04
（4）PCR扩增的过程
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
4.PCR的过程
目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
（1）变性
①温度：
②具体变化：
上升到90℃以上
双链DNA解旋为单链
（2）复性
①温度：_____________
②具体变化：
下降到50℃左右
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
（3）延伸
①温度：_____________
②具体变化：
上升到72℃左右
4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
（4）重复循环
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
思考：
1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？
2.引物是什么？在复性过程中引物结合到模板链的哪一端？
3.延伸过程是否需要ATP供能？
4.PCR为什么需要引物？
氢键；不需要酶，需要90℃以上的高温
短单链核酸3’端
不需要；由dNTP水解供能
DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链
（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）
2022-10-04
拓展1：3.获取目的基因的其他方法
（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
基因组文库
②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
反（逆）转录酶
单链互补DNA
DNA聚合酶
双链DNA片段
与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
cDNA文库
真核细胞的cDNA的获取
编码区
非编码区
非编码区
DNA聚合酶
剪接有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
2022-10-04
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
2022-10-04
2022-10-04
（2）利用化学方法人工合成
①需要仪器：DNA合成仪。
②适用目的基因类型：要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知；
③不需要模板。
2022-10-04
作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
二、基因表达载体的构建（核心）
1 构建表达载体的目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
2022-10-04
2.基因表达载体的结构
启动子
（1）启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达。
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
2022-10-04
启动子
（2）终止子： 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游（尾端），标志着转录的停止。
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
（3）标记基因
①作用：便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
（4）目的基因：如Bt基因。
（5）复制原点
作用：使能完成自主复制。
2022-10-04
质粒
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
限制酶
获取目的基因
连接酶
重组DNA分子
载体（质粒）
含有目的基因的DNA片段
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割
带有黏性末端（或平末端）的切口
带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
3.基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
同一种限制酶切割获得的目的基因和载体混合后，加DNA连接酶会出现的两两连接的方式有：
自连
片段间两两连接
目的基因自身环化
载体自身环化
目的基因与目的基因连接
载体与载体连接
目的基因与载体连接
2022-10-04
拓展2：
故实际应用中往往选择两种不同的限制酶分别切割，减少自连情况出现；还应用标记基因对重组DNA进行筛选。
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三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
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（2）农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
②特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
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③实验思路（过程）：
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
④具体转化方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
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⑤农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
（1）受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
3.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
1.目的
①检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
②检查转基因生物是否培育成功；
2.目的基因的检测与鉴定方法
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR、分子杂交技术等
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状）
抗性测定、个体性状测定等
四、目的基因的检测与鉴定
思考：
如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA？
①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测；
②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测；
拓展3：分子杂交技术
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA。
拓展4：抗原-抗体杂交技术
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质
酶联反应：固学案P16：7题
思考：
1.在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？
2.在酶联反应中，测量指标为什么？
抗原
显色反应，看颜色深浅
拓展5：个体生物学水平的鉴定的具体做法
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未侵染上病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
3.目的基因的检测与鉴定方法的顺序
基因工程的基本操作流程图
练习与应用
1：√ × ×
2：D
拓展应用
1：提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。
例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2022-10-04
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1）答案：ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
2）答案：不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
3）提示：维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。
关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。