3.2基因工程的基本操作程序课件2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3(共64张PPT)

(共64张PPT)
1.2 基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序
2.基因工程每一步涉及的技术和方法
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
从社会中来
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
棉花细胞
导入
抗虫棉
培育
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
1.目的基因的获取和筛选
1.概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子；
与生物抗逆性相关的基因
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因
与毒物降解相关的基因
与工业所需酶相关的基因
……
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
与RNA聚合酶结合位点
非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等
原核细胞基因
编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的DNA序列
内含子：不能编码蛋白质DNA的序列
有调控作用,与原核生物具
有相似功能的启动子、终止子
与RNA聚合酶结合位点
真核细胞基因
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的
相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的
非编码区
非编码区
编码区
RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
终止子
原核细胞
真核细胞
终止子：
注意：
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子：
起始密码子和终止密码子：
一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。
它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾
端，作用是使转录过程停止。
位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
目的基因获取方法
从基因文库中获取
通过DNA合成仪直接合成
利用PCR获取和扩增目的基因
1.目的基因的获取和筛选
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
1.从基因文库中直接获取：
2、获取目的基因的常用方法有哪些
未知序列
已知序列
1.基因文库
(1)概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体
菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
(2)种类
基因组文库:含有一种生物的全部基因
部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因,如：cDNA文库
(3)建基因文库的目的
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因
基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶切割
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
重组载体
基因组文库
导入受体菌中储存
①基因组文库的构建
1.从基因文库中直接获取：
cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
单链DNA
双链cDNA片段
重组载体
与载体连接
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
注意
①基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子
②cDNA文库中的基因不含以上结构
基因组文库和部分基因文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。
优点:操作简便
缺点:工作量大，具有一定的盲目性
从基因文库中获取目的基因：
问：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢
答：根据目的基因的有关信息来获取目的基因。
如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，基因的表达产物蛋白质等特性.
1.下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是(　　)
A.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因
B.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同C.cDNA文库中的基因没有启动子
D.一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种
B
目的基因的获取
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
2.利用PCR获取和扩增目的基因：
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
1.目的基因的获取和筛选
发明者：穆里斯
体内DNA复制要点回顾:
条件
原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则:
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
1.目的基因的获取和筛选
PCR扩增仪
知道目的基因的两端核苷酸序列，基因又比较大
前提：
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
1.目的基因的获取和筛选
1.体外PCR的条件：
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？
如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
a.什么是引物
1.目的基因的获取和筛选
1.体外PCR的条件：
在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始台成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
PCR引物设计原则
①引物长度要适宜
②引物GC含量要适宜
③引物自身及引物之间不应存在互补序列
④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰
⑤退火温度要适宜
PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。
设计的目的是在两个目标间取得平衡: 扩增特异性和高效性。
A T C G A A T C G G T T
T A C C T T A G C C A A
DNA
聚合酶
母链
DNA
子链
DNA
引物
3′
3′
5′
5′
PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。
耐高温的DNA聚合酶——Taq酶
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
美国黄石公园的热泉
75 ℃
特点：耐高温，在高温下仍有较高活性
b.什么是Taq酶
1.目的基因的获取和筛选
PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在PCR中的作用
前提条件
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
已知基因的核苷酸序列
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
1.目的基因的获取和筛选
c.PCR的过程：
变性：加热至90～95 ℃，________________；
复性：冷却至________℃，引物结合到互补DNA链；
延伸：加热至70～75 ℃，_________________(Taq酶)
从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。
DNA解链为单链
55～60
热稳定DNA聚合酶
d.前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
子链延伸方向：从5`端到3`端延伸
2.PCR扩增目的基因的过程：
1.目的基因的获取和筛选
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(55℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
第1步：变性
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
2.PCR扩增目的基因的过程：
1.目的基因的获取和筛选
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
①变性
95
50
72
℃
预变性 90 ℃以上 增加大分子模板DNA彻底变性的概率
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高。
当温度下降到55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
2.PCR扩增目的基因的过程：
1.目的基因的获取和筛选
5’
3’
3’
5’
第2步：复性
①变性
②复性
冷却
5’
3’
3’
5’
95
50
72
℃
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
2.PCR扩增目的基因的过程：
1.目的基因的获取和筛选
①变性
②复性
③延伸
冷却
加热
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
第3步：延伸
95
50
72
℃
变性：加热至90～95℃，DNA解链为单链；
复性：冷却至55～60℃，引物与DNA模板结合，形成局部双链
延伸：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
1.目的基因的获取和筛选
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
2.PCR扩增目的基因的过程：
1.目的基因的获取和筛选
①变性
②复性
③延伸
冷却
加热
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
每次循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成指数式扩增(2n)。
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
90
50
72
℃
变性
3`
5`
5`
3`
拓展：第几代子代DNA，会出现与目的基因等长的基因序列？
90
50
72
℃
退火
90
50
72
℃
延伸
第一代子代DNA
90
50
72
℃
变性
90
50
72
℃
退火
90
50
72
℃
延伸
第二代子代DNA
90
50
72
℃
变性
90
50
72
℃
退火
90
50
72
℃
延伸
第三代子代DNA
第3次复制，会出现与目的基因等长的基因序列
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子数为：______个
②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_______个
③子代含有的等长目的基因数目：_______个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物______________个
⑥第n次复制需要引物_________个
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR扩增DNA规律
2n-2n
1、复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
思考：
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
1.目的基因的获取和筛选
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式
场所
引物
酶
温度
结果
联系 解旋酶催化，边解旋边复制
高温变性解旋，全部解旋后再复制
主要在细胞核内
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
RNA
通常是DNA
解旋酶、DNA聚合酶等
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
细胞内温和条件
在不同温度(较高)下进行
合成整个DNA分子
扩增特定的DNA片段或基因
①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板
③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
②酶:均需DNA聚合酶
④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链
1.目的基因的获取和筛选
3.人工合成：
DNA合成仪
（1）前提：
（2）方法：
1.目的基因的获取和筛选
②获取合适的目的基因：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
（3）反转录法：
以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
基因的核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
（4）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
（化学合成法）
目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
1.目的基因的获取和筛选
1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是
A、化学合成法 B、基因组文库法
C、cDNA文库法 D、聚合酶式链反应
2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是
①从基因文库中获取目的基因
②利用PCR技术扩增目的基因 ③逆转录法
④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
D
D
目的基因的获取
3.下列有关PCR技术的说法，不正确的是(　　)
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA双链复制
C.利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列
D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA
D
目的基因的获取
(1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是
______________________________________________________________。
(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计
种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是
______________________________________________________________。
【例4】如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题
不需要
PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶
两
①90∽95度高温使DNA解聚为单链，
②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
一.目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是
　　 ，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
(4)目的基因能被准确扩增的原因是
___________________________________________________。
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行
(2n+1-2)=62
一.目的基因的筛选与获取
3.2 基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序
2.基因工程每一步涉及的技术和方法
2.基因表达载体的构建
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，①游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。②目的基因不含启动子，无法进行转录和翻译。
（1）启动子：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
① ;
② 。
1.目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
2.组成
（启动子≠起始密码）
①本质：
一段有特殊序列结构的_____片段。
DNA
②位置：
位于基因的____，
紧挨_________________。
上游
转录的起始位点
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
2.基因表达载体的构建
2.基因表达载体的构建
（2）终止子：
①本质：
一段有特殊序列结构的_______片段。
DNA
②位置：
位于基因的_____。
下游
③功能：
使转录在所需要的地方停下来,终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
（4）目的基因：
②常见类型：
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
如Bt基因,能控制表达所需要的特殊性状。
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到_________与_________之间。
启动子 终止子
（终止子≠终止密码）
一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。
筛选含目的基因(重组DNA分子)的受体细胞
2.基因表达载体的构建
DNA复制的起始位点
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②工具酶：限制酶、DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
2.基因表达载体的构建
注意
基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。
重组DNA分子
目的基因
2.基因表达载体的构建
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
——基因工程的核心
2.基因表达载体的构建
重组DNA分子
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
？
一般用同一种 酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用 酶把两者连接(如图)。
①单酶切
限制
DNA连接
2.基因表达载体的构建
①单酶切
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接
2.基因表达载体的构建
a
b
a
b
②双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
2.基因表达载体的构建
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
总结归纳
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
mRNA上三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA
决定转录
的结束
翻译的
起始信号
决定翻译过程的结束
2.基因表达载体的构建
如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　 )
B
A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.图示过程是基因工程的核心步骤
D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
1、下列哪项不是基因表达载体的组成部分(　　)
A．启动子 B．终止密码子 C．标记基因 D．目的基因
B
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(　　)
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
A
2.基因表达载体的构建