生物人教版（2019）选择性必修3 3.2 基因工程的基本操作程序（共89张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版（2019）选择性必修3 3.2 基因工程的基本操作程序（共89张ppt） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 18.4MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-10-21 04:45:29 | ||
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文档简介
(共89张PPT)
01
目的基因的筛选与获取
目录 /CONTENTS
04
目的基因的检测与鉴定
第2节 基因工程的基本操作程序
01
目的基因的筛选与获取
一、目的基因
1.概念:
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
2.作用:
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
3.实例:
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白
（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。
培育转基因抗虫棉用到的目的基因
Bt 抗虫蛋白基因
简称 Bt 基因
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
【相关信息】P77
①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
1. 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因
是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
01
目的基因的筛选与获取
二、筛选合适的目的基因
二、筛选合适的目的基因
2. 较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
3. 认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、
序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
01
目的基因的筛选与获取
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
01
目的基因的筛选与获取
1.PCR的含义：
PCR是聚合酶链式反应的缩写。
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2.PCR的原理：
DNA半保留复制
PCR扩增仪
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
01
目的基因的筛选与获取
【重温】DNA复制的过程
解旋
合成子链
形成新DNA
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
（1）解旋
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
（2）合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
（3）重新螺旋形成新的DNA分子
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
(Taq酶）
人工合成的引物
（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如能量、缓冲液等
PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
1.PCR的含义：
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
01
目的基因的筛选与获取
2.PCR的原理：
3.PCR的条件：
DNA模板、
4种脱氧核苷酸、
耐高温DNA聚合酶（Taq酶）、
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
用于PCR的引物长度通常为
20~30个核苷酸。
引物结合在
模板链的3’端
3′
5′
子链的延伸方向是5 ′→3 ′？
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
子链合成需要引物？
4.PCR的过程：
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA自动解聚为单链。
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
不需要解旋酶
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
②复性
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则延伸合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
95℃
50℃
72℃
退火
第二轮循环的产物
第三轮的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
【特别提示】PCR扩增过程中 、 需要源源不断的加入。
引物
原料
5.PCR的结果:
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
6.PCR产物的鉴定:
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
01
目的基因的筛选与获取
4.PCR的过程:
【三点提醒】
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行
复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
脱氧核苷三磷酸
复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之问的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
难点剖析
思考
思考
获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
至少要三次循环。
难点剖析
（3）要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
（4）如果循环n次，则共需消耗 个引物。
则共需消耗 对引物。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
2n－1
2n+1－2
（5）两种引物都结合在DNA模板链的 端；
脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。
3’
（6）设计引物的依据是？
已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。
3’
（1）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （ ）
（2）PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （ ）
（3）PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （ ）
（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （ ）
判断常考语句，澄清易混易错
【补充1】基因的结构
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，
进一步编码（翻译）
出蛋白质的DNA区段。
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
一、原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
非编码区：
含有能调控遗传信息表达的DNA序列
不转录，不编码蛋白质
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
二、真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
数量关系：外显子=内含子 + 1
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
转录
初级RNA
成熟mRNA
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？
剪切、拼接
DNA聚合酶
单链DNA
cDNA
逆转录酶
逆转录
复制
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
1. 常用 PCR 快速扩增目的基因。
2. 人工合成目的基因。
【补充2】获取目的基因的方法
条件：
基因较小、核苷酸序列已知，
可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
【补充】获取目的基因的方法
1. 常用 PCR 快速扩增目的基因。
3. 通过构建基因文库来获取目的基因。
2. 人工合成目的基因。
【补充】通过构建基因文库来获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
（2）基因文库的种类
基因组文库
部分基因文库
（1）什么叫基因文库？
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
互补DNA
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
（1）基因文库的构建
限制酶
与载体连接 导入
基因组文库
基因组文库
某生物某个时期的mRNA
cDNA（互补DNA）
逆转录
受体菌群体
与载体连接 导入
部分基因文库
（如：cDNA文库）
（1）基因文库的构建
cDNA文库
【说明】基因文库中不是直接储存相应基因，而是保存受体菌，受体菌中含有基因。
目录 /CONTENTS
04
目的基因的检测与鉴定
第2节 基因工程的基本操作程序
02
基因表达载体的构建
01
目的基因的筛选与获取
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
基因的上游（一段有
特殊结构的DNA片段）
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的下游
（一段特殊的DNA片断）
终止mRNA的
转录
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
DNA复制所需结构
【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
1．基因表达载体构建的目的
①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
2．基因表达载体的组成：
②同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因工程的核心工作
目的基因
启动子
终止子
标记基因
复制原点
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
【区分两组概念】
位于基因上
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
本身不转录
决定氨基酸
不决定氨基酸
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
②再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
【问题探究6】请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选。若被破坏，无法进一步筛选。
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能，有何弊端？
能
①质粒、目的基因会发生自身环化连接；
②会发生两两自身连接；
③质粒与目的基因会发生反向连接。
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
【核心归纳】图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或
平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
3．基因表达载体构建的过程
培育抗虫棉的简要过程
使用一种限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，
防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
难点剖析
1.前面说用应该同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？
不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。
而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。
难点剖析
2.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？
如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。
（2）目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
课堂练习
（1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （ ）
（2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （ ）
（3）标记基因不一定是抗生素抗性基因 （ ）
（4）当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因
的表达（ ）
判断常考语句，澄清易混易错
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 ( )
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
课堂练习
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
问题思考
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
1. 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
自主阅读课本相关内容，总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，
实质都是基因重组。
三、将目的基因导入受体细胞
三、将目的基因导入受体细胞
2. 转化的受体细胞
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去
柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
适用生物：开花植物
三、将目的基因导入受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法（我国独创）
适用生物：双子叶植物
三、将目的基因导入受体细胞
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
植物组织培养
（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法
重点剖析
1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
操作程序：
（2）将目的基因导入动物细胞--显微注射法
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）
获得具有新性状的动物
①体积大，易操作；
②全能性高，易培养成完整个体。
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
（常用大肠杆菌）
优点：
繁殖周期短
体积小易于培养操作
多为单细胞
遗传物质相对较少
（3）将目的基因导入微生物细胞----Ca2+处理法
使用Ca2+处理：
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
大肠杆菌细胞
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
课堂总结
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
——显微注射法
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
问题思考
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
1.目的:
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
04
目的基因的检测与鉴定
② 检测目的基因是否转录出了mRNA
③ 目的基因是否翻译成蛋白质
④ 个体的抗性及抗性程度
分子水平的检测
个体生物水平的鉴定
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
① 首先取出转基因生物的基因组DNA。
② 将含目的基因的DNA
片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。
分子杂交技术
基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA分子杂交（可检测）
变性
原理：
碱基互补配对原则
RT-PCR
方法：PCR扩增或分子杂交技术
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
② 检测目的基因是否转录出了mRNA
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
③ 目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
④个体水平检测：抗性以及抗性程度
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上 是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平 鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测， 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
课堂总结
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，
然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。
下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
课堂练习
1. 在PCR反应体系中，应包含一对特异性引物以及一个特异性荧光DNA探针。引物可根据_____________________________________来合成。探针带着淬灭基团可吸收荧光基团发出的光，此时是没有荧光的。根据图所示可知，DNA单链合成的过程中，__________________酶会“消化”掉探针,使荧光基团游离出来。每扩增一条DNA链，就有_______荧光分子产生。
2. 荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值），病毒核酸浓度越高，Ct值越_______。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。
新型冠状病毒的一段已知序列RNA片段
热稳定DNA聚合
一个
越小
课堂练习
3.2 基因工程的基本操作程序
（第三课时）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
自主探究
1、实验原理
2、实验器材
3、实验步骤
4、实验结果
1. DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
2. DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
实验原理
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
实验器材
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
实验器材
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
实验步骤（PCR）
用PCR可以扩增mRNA吗？
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
难点剖析
思考
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
单链RNA
杂交双链
单链DNA
双链DNA
RNA链
DNA链
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
实验步骤（电泳鉴定）
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
实验步骤（电泳鉴定）
1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2. 你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
结果分析
1
如何对产物进行鉴定吗？
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向看与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
难点剖析
思考
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
课堂练习
例2：通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（ ）
A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等
C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
A
课堂练习
例3：科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：
（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是
_________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。
（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是____________________，PCR定点突变技术属于_______的范畴.
（3）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用_______________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是___________________。
DNA双链复制
耐高温的
DNA聚合酶
引物
能生产出自然界不存在
蛋白质
蛋白质空间结构较为复杂，改造困难
引物
农杆菌转化法
植物细胞的全能性
课堂练习
例4：实时荧光 RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在 PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA 聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用 RT-PCR 进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为 PCR扩增的模板，故需要将样本中的 RNA反转录为 DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原-抗体杂交
课堂练习
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01
目的基因的筛选与获取
目录 /CONTENTS
04
目的基因的检测与鉴定
第2节 基因工程的基本操作程序
01
目的基因的筛选与获取
一、目的基因
1.概念:
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
2.作用:
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
3.实例:
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白
（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。
培育转基因抗虫棉用到的目的基因
Bt 抗虫蛋白基因
简称 Bt 基因
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
【相关信息】P77
①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
1. 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因
是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
01
目的基因的筛选与获取
二、筛选合适的目的基因
二、筛选合适的目的基因
2. 较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
3. 认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、
序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
01
目的基因的筛选与获取
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
01
目的基因的筛选与获取
1.PCR的含义：
PCR是聚合酶链式反应的缩写。
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2.PCR的原理：
DNA半保留复制
PCR扩增仪
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
01
目的基因的筛选与获取
【重温】DNA复制的过程
解旋
合成子链
形成新DNA
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
（1）解旋
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
（2）合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
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T
C
G
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G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
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C
G
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T
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T
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T
A
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3'
5'
A
C
G
C
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T
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G
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A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
（3）重新螺旋形成新的DNA分子
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
(Taq酶）
人工合成的引物
（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如能量、缓冲液等
PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
1.PCR的含义：
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
01
目的基因的筛选与获取
2.PCR的原理：
3.PCR的条件：
DNA模板、
4种脱氧核苷酸、
耐高温DNA聚合酶（Taq酶）、
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
用于PCR的引物长度通常为
20~30个核苷酸。
引物结合在
模板链的3’端
3′
5′
子链的延伸方向是5 ′→3 ′？
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
子链合成需要引物？
4.PCR的过程：
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA自动解聚为单链。
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
不需要解旋酶
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
②复性
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则延伸合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
95℃
50℃
72℃
退火
第二轮循环的产物
第三轮的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
【特别提示】PCR扩增过程中 、 需要源源不断的加入。
引物
原料
5.PCR的结果:
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
6.PCR产物的鉴定:
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
★ 三、利用PCR获取和扩增目的基因
01
目的基因的筛选与获取
4.PCR的过程:
【三点提醒】
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行
复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
脱氧核苷三磷酸
复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之问的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
难点剖析
思考
思考
获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
至少要三次循环。
难点剖析
（3）要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
（4）如果循环n次，则共需消耗 个引物。
则共需消耗 对引物。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
2n－1
2n+1－2
（5）两种引物都结合在DNA模板链的 端；
脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。
3’
（6）设计引物的依据是？
已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。
3’
（1）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （ ）
（2）PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （ ）
（3）PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （ ）
（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （ ）
判断常考语句，澄清易混易错
【补充1】基因的结构
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，
进一步编码（翻译）
出蛋白质的DNA区段。
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
一、原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
非编码区：
含有能调控遗传信息表达的DNA序列
不转录，不编码蛋白质
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
二、真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
数量关系：外显子=内含子 + 1
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
转录
初级RNA
成熟mRNA
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？
剪切、拼接
DNA聚合酶
单链DNA
cDNA
逆转录酶
逆转录
复制
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
1. 常用 PCR 快速扩增目的基因。
2. 人工合成目的基因。
【补充2】获取目的基因的方法
条件：
基因较小、核苷酸序列已知，
可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
【补充】获取目的基因的方法
1. 常用 PCR 快速扩增目的基因。
3. 通过构建基因文库来获取目的基因。
2. 人工合成目的基因。
【补充】通过构建基因文库来获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
（2）基因文库的种类
基因组文库
部分基因文库
（1）什么叫基因文库？
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
互补DNA
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
（1）基因文库的构建
限制酶
与载体连接 导入
基因组文库
基因组文库
某生物某个时期的mRNA
cDNA（互补DNA）
逆转录
受体菌群体
与载体连接 导入
部分基因文库
（如：cDNA文库）
（1）基因文库的构建
cDNA文库
【说明】基因文库中不是直接储存相应基因，而是保存受体菌，受体菌中含有基因。
目录 /CONTENTS
04
目的基因的检测与鉴定
第2节 基因工程的基本操作程序
02
基因表达载体的构建
01
目的基因的筛选与获取
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
基因的上游（一段有
特殊结构的DNA片段）
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的下游
（一段特殊的DNA片断）
终止mRNA的
转录
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
DNA复制所需结构
【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
1．基因表达载体构建的目的
①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
2．基因表达载体的组成：
②同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因工程的核心工作
目的基因
启动子
终止子
标记基因
复制原点
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
【区分两组概念】
位于基因上
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
本身不转录
决定氨基酸
不决定氨基酸
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
②再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
【问题探究6】请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选。若被破坏，无法进一步筛选。
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能，有何弊端？
能
①质粒、目的基因会发生自身环化连接；
②会发生两两自身连接；
③质粒与目的基因会发生反向连接。
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
【核心归纳】图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或
平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
3．基因表达载体构建的过程
培育抗虫棉的简要过程
使用一种限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，
防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
难点剖析
1.前面说用应该同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？
不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。
而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。
难点剖析
2.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？
如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。
（2）目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
课堂练习
（1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （ ）
（2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （ ）
（3）标记基因不一定是抗生素抗性基因 （ ）
（4）当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因
的表达（ ）
判断常考语句，澄清易混易错
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 ( )
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
课堂练习
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
问题思考
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
1. 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
自主阅读课本相关内容，总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，
实质都是基因重组。
三、将目的基因导入受体细胞
三、将目的基因导入受体细胞
2. 转化的受体细胞
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去
柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
适用生物：开花植物
三、将目的基因导入受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法（我国独创）
适用生物：双子叶植物
三、将目的基因导入受体细胞
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
植物组织培养
（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法
重点剖析
1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
操作程序：
（2）将目的基因导入动物细胞--显微注射法
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）
获得具有新性状的动物
①体积大，易操作；
②全能性高，易培养成完整个体。
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
（常用大肠杆菌）
优点：
繁殖周期短
体积小易于培养操作
多为单细胞
遗传物质相对较少
（3）将目的基因导入微生物细胞----Ca2+处理法
使用Ca2+处理：
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
大肠杆菌细胞
三、将目的基因导入受体细胞（补充）
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
课堂总结
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
——显微注射法
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
问题思考
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
1.目的:
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
04
目的基因的检测与鉴定
② 检测目的基因是否转录出了mRNA
③ 目的基因是否翻译成蛋白质
④ 个体的抗性及抗性程度
分子水平的检测
个体生物水平的鉴定
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
① 首先取出转基因生物的基因组DNA。
② 将含目的基因的DNA
片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。
分子杂交技术
基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA分子杂交（可检测）
变性
原理：
碱基互补配对原则
RT-PCR
方法：PCR扩增或分子杂交技术
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
② 检测目的基因是否转录出了mRNA
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
③ 目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
④个体水平检测：抗性以及抗性程度
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上 是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平 鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测， 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
课堂总结
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，
然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。
下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
课堂练习
1. 在PCR反应体系中，应包含一对特异性引物以及一个特异性荧光DNA探针。引物可根据_____________________________________来合成。探针带着淬灭基团可吸收荧光基团发出的光，此时是没有荧光的。根据图所示可知，DNA单链合成的过程中，__________________酶会“消化”掉探针,使荧光基团游离出来。每扩增一条DNA链，就有_______荧光分子产生。
2. 荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值），病毒核酸浓度越高，Ct值越_______。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。
新型冠状病毒的一段已知序列RNA片段
热稳定DNA聚合
一个
越小
课堂练习
3.2 基因工程的基本操作程序
（第三课时）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
自主探究
1、实验原理
2、实验器材
3、实验步骤
4、实验结果
1. DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
2. DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
实验原理
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
实验器材
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
实验器材
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
实验步骤（PCR）
用PCR可以扩增mRNA吗？
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
难点剖析
思考
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
单链RNA
杂交双链
单链DNA
双链DNA
RNA链
DNA链
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
实验步骤（电泳鉴定）
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
实验步骤（电泳鉴定）
1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2. 你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
结果分析
1
如何对产物进行鉴定吗？
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向看与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
难点剖析
思考
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
课堂练习
例2：通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（ ）
A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等
C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
A
课堂练习
例3：科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：
（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是
_________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。
（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是____________________，PCR定点突变技术属于_______的范畴.
（3）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用_______________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是___________________。
DNA双链复制
耐高温的
DNA聚合酶
引物
能生产出自然界不存在
蛋白质
蛋白质空间结构较为复杂，改造困难
引物
农杆菌转化法
植物细胞的全能性
课堂练习
例4：实时荧光 RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在 PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA 聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用 RT-PCR 进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为 PCR扩增的模板，故需要将样本中的 RNA反转录为 DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原-抗体杂交
课堂练习
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