人教(2019)生物选择性必修3（知识点+跟踪检测）第1讲 基因工程(含答案）
文档属性
| 名称 | 人教(2019)生物选择性必修3（知识点+跟踪检测）第1讲 基因工程(含答案） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.6MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2022-11-22 22:44:16 | ||
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文档简介
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人教(2019)生物选择性必修3（知识点+跟踪检测）
第1讲 基因工程
【课标导航】
5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的
5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具
5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤
5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质
5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质
5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
3．蛋白质工程
4．DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．实验流程
[基础微点练清]
1．判断正误
(1)海鱼的抗冻蛋白基因是培育抗冻番茄的目的基因(√)
[新人教版选择性必修3 P83“概念检测”T1(1)]
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)
(4)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(5)构建含有目的基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶(×)
[新人教版选择性必修3 P83“概念检测”T1(2)]
(6)利用乳腺生物反应器生产药物属于基因工程的应用[新人教版选择性必修3 P92“概念检测”T2B](√)
(7)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(×)
(8)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同(×)
2．下列有关限制酶的叙述正确的是( )
A．用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
解析：选B 用限制酶切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需剪切2次，水解磷酸二酯键4个；限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端均有4个碱基；切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系，则两末端也可连接。
3．(新人教版选择性必修3 P74“概念检测”T1)DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( )
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
解析：选C DNA连接酶的作用是连接末端互补的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键。
4．(新人教版选择性必修3 P74“拓展应用”T1)想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示：生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
一、基因工程的操作工具
[试考题·查欠缺]
1．(全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括__________________和________________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(90～95 ℃)使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
答案：(1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
2．(全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。
解析：(1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
[强知能·补欠缺]
(一)基因工程中两种工具酶
1．限制酶的特点与使用
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
2．DNA连接酶
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3．与DNA有关的酶的比较
比较项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
形成产物 黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 新的DNA分子 形成单链DNA
(二)基因工程中的载体
1．基因工程载体应具备的条件
(1)能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。
(2)具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。
(3)具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。
2．基因工程载体与膜载体的区别
基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
3．载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
[练题点·全过关]
1．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_____________________________________
_________________________________________。
(3)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(4)基因工程中除质粒外，________和________也可作为载体。
解析：(1)当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。(2)为使载体与目的基因相连，不同的限制性核酸内切酶应该切出相同的黏性末端。(3)反转录是指以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR(多聚酶链式反应)。(4)基因工程中可以作为载体的除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
答案：(1)黏性末端 平末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
(3)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR
(4)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
2．(2021年1月新高考8省联考·福建卷，节选)阅读下列材料，完成有关问题。
材料：在全球气候变暖和水资源缺乏加剧的情况下，保障我国“粮食安全”问题尤为重要。玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。
超量表达P蛋白转基因玉米的获得与鉴定
在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示；P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。
回答下列问题：
(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被____________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用__________酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。T DNA在该实验中的作用是________________________________________________________________________
__________________________。
(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入__________进行筛选，筛选出的愈伤组织________形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。
(3)据图2分析，选择a1、a2、a3玉米株系，作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究的实验材料，理由是_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)根据“驱动基因的持续转录”可知，强启动子能被RNA聚合酶识别并结合。为使P基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和P基因不被破坏，故应优先选用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。T DNA在该实验中的作用是将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞的染色体DNA上。(2)由图1可知，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T DNA上，可以随T DNA整合到玉米细胞的染色体上，故将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。(3)据图2分析，a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表达量显著高于野生型玉米，故可以选择a1、a2、a3玉米株系，作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究的实验材料。
答案：(1)RNA聚合酶 BamH Ⅰ和Sac Ⅰ 将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上 (2)潮霉素 (再)分化 (3)a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表达量显著高于野生型玉米
二、基因工程的基本操作程序
[试考题·查欠缺]
1．(2021年1月新高考8省联考·江苏卷)啤酒生产需经过制麦、糖化、发酵等主要环节。糖化主要是将麦芽中的淀粉等有机物水解为小分子的过程。主要工艺流程如下图所示，请回答下列问题：
(1)大麦是啤酒发酵的重要碳源，针对制麦及糖化步骤，下列说法正确的有_________(填序号)。
①大麦萌发时仅产生淀粉酶，几乎不产生蛋白酶
②用赤霉素处理大麦，可诱导淀粉酶的合成
③酵母不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖
④糖化采用的温度越高，淀粉水解速度越快
(2)啤酒发酵时具有活力的酵母需达到一定的数量，故在菌种活化的过程中，需定时取样，检测酵母的生长状况。若某次样品经2次10倍稀释后，经台盼蓝染色(体积不计)，在25×16型血细胞计数板上计数_________色细胞，5个中格中的细胞数为244个，该样品中活酵母细胞的密度为_________个细胞/mL。
(3)敲除酿酒酵母中的蛋白酶基因，减少发酵液中蛋白的水解，有助于增强啤酒泡沫的稳定性，从而改善啤酒的品质。以下是某科研小组的实验：
①已知编码酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列如下(为非模板链)：
编码该酶的mRNA，起始端的三个密码子依次为______，终止密码子为________。
②Cas9蛋白可在人为设定的RNA序列(sgRNA)引导下，在选定位点切断相应的DNA链(如下图)，在DNA自我连接的修复过程中产生突变。DNA序列中含NGG的位点具有较高的编辑效率(N为任意碱基)。
上述PEP4序列虚线框中有________处可作为Cas9的优选剪切位点。Cas9的剪切位点在其NGG识别位点的________________(填“5′”或“3′”)侧。
③用酪蛋白固体培养基筛选突变体，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周围形成透明圈。需要筛选透明圈________的菌落，表明其蛋白酶活性__________。
解析：(1)大麦萌发时会产生淀粉酶、蛋白酶等，①错误；赤霉素处理大麦，可诱导淀粉酶的合成，促进种子萌发，②正确；酵母细胞呼吸的底物为葡萄糖，不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖，③正确；酶的催化需要适宜的温度，糖化采用的温度过高，会影响酶的活性，使淀粉水解速度变慢，④错误。(2)细胞膜具有选择透过性，台盼蓝不能进入活细胞，染色后用血细胞计数板计数时应对无色细胞进行计数，若某次样品经2次10倍稀释后，在25×16型血细胞计数板上计数，5个中格中的细胞数为244个，则该样品中活酵母细胞的密度为244÷5×25÷0.1×102×103＝1.22×109个/mL。(3)①已知编码酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列为(为非模板链)：
5′ ATGTTCAGCTTCAAAGCATTATTGCCATTGGCCTTG
TTGTGGTGAGCGCC……CAATTTGA 3′，模板链与非模板链方向相反，RNA 5′端为起始端，起始端的三个密码子依次为AUG、UUC、AGC，终止密码子为UGA。②DNA序列中含NGG的位点具有较高的编辑效率(N为任意碱基)。根据PEP4序列虚线框中的碱基序列，有4处可作为Cas9的优选剪切位点。据图可知，Cas9的剪切位点在其NGG识别位点的3′侧。③敲除酿酒酵母中的蛋白酶基因，减少发酵液中蛋白的水解，有助于增强啤酒泡沫的稳定性，从而改善啤酒的品质。用酪蛋白固体培养基筛选突变体，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周围形成透明圈。因此需要筛选透明圈较小的菌落，表明其蛋白酶活性较低。
答案：(1)②③ (2)无 1.22×109 (3)①AUC、UUC、ACC UGA ②4 3′ ③小 较低
2．(2018·天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加______________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。
解析：(1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。(4)不具有感染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。
答案：(1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)细胞
3．(2018·江苏高考有改动)为生产具有特定性能的α 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α 淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间
⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α 淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4 KH2PO4 50 mmol/L Tris HCl 50 mmol/L Gly NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相对活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
根据上述实验结果，初步判断该α 淀粉酶活性最高的条件为________________________________________________________________________。
解析：(1)利用PCR技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α 淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris HCl。
答案：(1)基因组DNA (2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 (3)② ⑥ (4)8 13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris HCl
[强知能·补欠缺]
1．获取目的基因的方法
(1)几种获取目的基因方法的比较
(2)诠释PCR技术
①PCR原理：DNA复制原理，即：
②PCR反应过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
③结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2．基因表达载体的组成
目的基因 能够控制特定性状
启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
终止子 RNA聚合酶脱离部位，终止转录
标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
4．目的基因检测与鉴定的方法
[练题点·全过关]
1．为生产高效价疫苗和简化计划免疫程序，科学家研制出基因工程乙肝－百白破(rHBDTP)四联疫苗，经各项检测均符合rHBDTP四联疫苗制检规程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌的四种类毒素。请分析回答下列问题：
(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应________，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列________(填“相同”或“不同”)。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用__________________，然后通过________大量扩增，此技术的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
(3)把目的基因导入受体细胞时，科学家采用了改造后的腺病毒作为载体，写出选它的理由：________________________________________________(写出2点)。
(4)研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的_________数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，二次免疫的特点是________________，免疫预防作用更强。
解析：(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应mRNA，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列不同。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用化学方法人工合成，然后通过PCR技术大量扩增。(3)改造后的腺病毒有多个限制酶切割位点、有标记基因，且能自主复制，因此可作为载体将目的基因导入受体细胞。(4)将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸利用的是蛋白质工程的原理，基本流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的记忆细胞数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，二次免疫的特点是短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞，免疫预防作用更强。
答案：(1)mRNA 不同 (2)化学方法人工合成 PCR技术 (3)能自主复制；有多个限制酶切割位点、有标记基因 (4)从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因) (5)记忆细胞 短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞
2．(2020·北京高考)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
(1)纤维素属于________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是____________。
(2)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列相同，这是因为________________________________________________________________________。
(3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________________________。
(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为_____________________________________________________________________。
(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用。(举一例)
解析：(1)纤维素是由葡萄糖聚合形成的多糖，所以纤维素经过酶的催化作用可降解为葡萄糖。(2)一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性。由于密码子具有简并性，即使克隆得到的C1酶基因序列与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列仍相同。(3)根据题干信息，C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，根据质粒上启动子的方向可判断酶切位点1对应的酶为BamHⅠ，而酶切位点2对应的酶为SmaⅠ。(4)比较图2中三组的实验结果可知，工程菌降解纤维素的能力最强，对照组2次之，对照组1中纤维素含量最高，由此判断，对照组2接种了降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌(B菌)。(5)该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以用该工程菌降解秸秆，以减少秸秆燃烧带来的环境污染。
答案：(1)多 葡萄糖 (2)密码子具有简并性 (3)BamHⅠ、Sma Ⅰ(顺序不能调换) (4)接种降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌(B菌) (5)降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的环境污染。
三、基因工程的应用与蛋白质工程
[试考题·查欠缺]
1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
2．(2019·海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是________________________________________________________________________。
解析：(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，T DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要将Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
答案：(1)mRNA 逆转录酶 PCR (2)T DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
3．(2020·山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是__________________________________________________________
________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录(或反转录)，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，3个突变品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
[强知能·补欠缺]
1．基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。
(3)比较基因治疗与基因诊断
原理 操作过程 进展
基因治疗 基因表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病) 临床实验
基因诊断 碱基互补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 临床应用
2．蛋白质工程
(1)流程图
(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
3．蛋白质工程与基因工程的关系
蛋白质工程 基因工程
区 别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
[练题点·全过关]
1．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质。下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“手术刀”能识别的序列和切点是，请回答下列问题：
(1)从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因的酶是________，人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是____________等。
(2)请写出质粒被切割形成黏性末端的过程。
(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是____________________________________，“插入”时用的工具是________，其种类有________________________________________________________________________等。
解析：(1)限制酶可以识别并切割特定的脱氧核苷酸序列，可用于从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因。“切下”的羊蛋白质基因，使用DNA连接酶将其与载体缝合，然后“插入”到羊的染色体中。 (2)图示的限制酶识别的序列为—GGATCC—，并且在G与G之间切开，因此形成的黏性末端为反向重复的，其过程见答案。(3)羊的染色体的主要成分是DNA和蛋白质，其中DNA上的基因与人体蛋白质基因的结构是相同的，因此人体蛋白质基因能“插入”到羊的染色体内。“插入”时用的工具是载体，其种类有质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等。
答案：(1)限制酶 DNA连接酶
(2)
(3)基因的结构相同 载体 质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物
2．(2019·江苏高考)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为，EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为__________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________________、____________________________。
平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，形成P2，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P2连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确(反向插入)时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，无法进行扩增鉴定，因此只能选用乙、丙作为引物，通过PCR鉴定目的基因是否插入正确。若扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
答案：(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙、丙 目的基因反向连接
四、DNA的粗提取与鉴定
[试考题·查欠缺]
1．(2020·海南高考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
解析：选A 羊是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，因此羊的成熟红细胞不能作为提取DNA的材料，A错误；提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是溶解细胞膜，而食盐的作用是溶解DNA，B正确；冷却的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，C正确；在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，D正确。
2．(2019·江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析：选A 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。
[强知能·补欠缺]
1．DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异
比较项目 DNA 蛋白质
溶解性 2 mol/L NaCl溶液中 溶解 析出
0.14 mol/L NaCl溶液中 析出 溶解
酒精溶液中 析出 溶解
耐受性 蛋白酶 无影响 水解
高温 80 ℃以上变性 不能忍受60～80 ℃的高温
2．DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、3、4”
加蒸馏水2次 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂； ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤3次 ①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液； ②滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)； ③过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质； ②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出； ③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物； ④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
3．DNA粗提取实验中的三个注意点
(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
(2)因DNA容易被玻璃容器吸附，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，减少提取过程中DNA的损失。
(3)每次用玻璃棒搅拌时都要沿同一方向，防止打碎DNA分子。
[练题点·全过关]
1．关于还原糖、蛋白质和DNA的鉴定实验，下列叙述正确的是( )
A．在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色
B．在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色
C．提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液
D．将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色
解析：选D 甘蔗茎的组织样液富含蔗糖，而蔗糖属于非还原糖，且不能用斐林试剂检测，A错误；大豆种子中富含蛋白质，先后加入双缩脲试剂A液和B液摇匀后，液体由蓝色变为紫色，B错误；提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤纸上的黏稠物，留下滤液，C错误；将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂并水浴加热，溶液由无色变为蓝色，D正确。
2．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，对DNA进行鉴定时，做如下操作：
步骤 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据如图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液的颜色为________________________________________________________________________
______________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是____________________，同时说明DNA对高温有较强的__________________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与___________________________________
_____________________________________有关。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液变蓝色 DNA在沸水浴的条件下遇二苯胺会变成蓝色
(2)基本不变(不呈蓝色)
(3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照
(5)DNA(丝状物)的多少
科学探究——探讨基因工程操作中限制酶的选择方法
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
3．根据Ti质粒的TDNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
[素养训练]
1．(2021·泉州月考)图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。据此判断下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是( )
A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和HindⅢ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
解析：选D PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图乙中引物甲和引物丙，A正确；选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确；将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中，需要用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，C正确；在构建基因表达载体时，使用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割质粒，氨苄青霉素抗性基因已被破坏，因此氨苄青霉素抗性基因在受体细胞中不能表达，D错误。
2．人体内的t PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t PA会诱发颅内出血，其原因在于tPA与纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的tPA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良tPA蛋白(注：如图表示相关的目的基因、载体、限制酶识别序列和切割位点，pCLY11为质粒，新霉素为抗生素)。请回答下列问题：
(1)以上制造出性能优异的改良tPA蛋白的过程被称为____________工程。
(2)已知人tPA基因序列已测出，且第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的模板链碱基序列为AGA，因此要获得改造后的目的基因最好采用____________________方法获得。
(3)若tPA改良基因的黏性末端如图所示，那么需选用限制酶XmaⅠ和__________切开质粒pCLY11，才能与tPA改良基因高效连接。在基因工程中，最核心的一步为________________________________。
(4)一般选择在未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，目的是__________________________________________。在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是______________________________________________，这时需选择呈__________色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌株。
解析：(1)在原有的tPA蛋白基础上改良蛋白质结构，属于蛋白质工程。(2)由于tPA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化学方法人工合成的方法获得目的基因。(3)目的基因的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知所使用的限制酶为XmaⅠ和BglⅡ，要想把目的基因与载体拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此载体也需要XmaⅠ和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建。(4)选择未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，这些细胞没有新霉素的抗性，当其导入重组质粒后，质粒上的标记基因使得大肠杆菌具有新霉素抗性，这样可以选择导入质粒pCLY11的大肠杆菌；由于标记基因存在于原有质粒上，若未连目的基因的质粒导入到大肠杆菌中，这些大肠杆菌也可以获得新霉素的抗性；而区分重组质粒和原有质粒的一个标志可以观察mlacZ基因的表达情况，由于重组质粒拼接了目的基因，破坏了mlacZ基因，因此在重组质粒中该基因不表达，菌落呈现白色，而导入非重组质粒的大肠杆菌由于该基因保存完整，可以表达，所以菌落呈现蓝色。
答案：(1)蛋白质 (2)化学方法人工合成 (3)BglⅡ 基因表达载体的构建 (4)以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌 含有未连目的基因质粒的大肠杆菌也可以在这种培养基上生长 白
一、对点练小题，落实主干知识
1．如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( )
A．限制酶、解旋酶、DNA连接酶
B．解旋酶、限制酶、DNA连接酶
C．解旋酶、DNA连接酶、限制酶
D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶
解析：选B ①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。
2．如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在乙图中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
解析：选C 由图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为：GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为：GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
3．下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B．检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术
C．目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的
D．如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子
解析：选A 目的基因在真核细胞中稳定遗传的关键是目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA上，A错误；通过抗原抗体杂交可以检测目的基因是否翻译成了蛋白质，检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术，B正确；目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的，如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，C正确；如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子，D正确。
4．下列是“肝脏细胞DNA粗提取”实验的两个关键操作步骤，相关叙述错误的是( )
A．步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定
B．步骤1中，冰浴处理的主要原理是低温下DNA酶容易变性
C．步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀
D．步骤2中，离心后应取上清液，因为DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比较大
解析：选B 步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定，A正确；低温不会使酶变性失活，只能降低酶的活性，B错误；步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀，C正确；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度比较大，因此加固体NaCl使溶液浓度达到2 mol/L后再离心过滤取上清液，D正确。
5．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C 目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上。
6．若要利用某目的基因(图甲)和质粒载体(图乙)构建重组DNA(图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
解析：选D 根据题意并分析图示可知，只有EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体，在构建的重组DNA中，RNA聚合酶在插入目的基因上的移动方向才与图丙相同。
二、系统练大题，强化科学思维
7．科学家将拟南芥的抗寒基因(CBFl)，转入香蕉以获得抗寒的香蕉品种。如图是某质粒载体上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ四种限制酶的切割位点示意图。据图回答问题：
(1)在该实验中为构建基因表达载体，用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后，对质粒载体进行切割的限制酶是________________，理由是________________________________________________________________________。
(2)连接CBFl基因到该质粒载体后，作为基因表达载体的组成还必须有__________________。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是__________________________。
(3)为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含______________的培养基进行筛选。
(4)科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行______________处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果__________________________________，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。
解析：(1)在基因工程中，用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端，所以和含目的基因的DNA一样，质粒也应使用SacⅠ、XbaⅠ进行切割。(2)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、标记基因、目的基因等。香蕉细胞是植物细胞，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(3)据图分析可知，质粒上的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，所以为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。(4)根据题干信息已知目的基因是抗寒基因，所以科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行低温处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果实验组的抗寒能力明显高于对照组，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。
答案：(1)SacⅠ、XbaⅠ 用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端 (2)启动子和终止子 农杆菌转化法 (3)氨苄青霉素 (4)低温 实验组的抗寒能力明显高于对照组
8．某实验小组利用转基因技术培育耐盐水稻，如图1表示含有耐盐基因的外源DNA分子，图2表示质粒，其上含有BamHⅠ、SmaⅠ和HindⅢ三种限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
(1)分析上图可知，欲构建重组DNA分子，应选用________________两种限制酶切割质粒和外源DNA分子，使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)题(1)中不使用另外一种限制酶切割的原因是__________________，题(1)中构建成功的重组质粒若用该酶切割能产生________种不同的DNA片段。
(3)质粒中抗性基因的作用是__________________。成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含______(填“氨苄青霉素”或“四环素”)的培养基中进行培养。
(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)外源DNA和质粒上都含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的识别序列和切割位点，但限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，应该选用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA分子；使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒可防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接。(2)构建成功的重组质粒含有3个限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点，因此若用该酶切割构建成功的重组质粒能产生3种不同的DNA片段。(3)质粒中抗性基因的作用是筛选和鉴定目的基因；构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，但氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含四环素的培养基中进行培养。(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接 (2)SmaⅠ会破坏目的基因 3 (3)筛选和鉴定目的基因 四环素 (4)将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长
9．科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶基因对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是______________，该过程需要加入的酶是________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中________(填“存在的”或“不存在的”)，PCR定点突变技术属于________工程的范畴。
解析：(1)PCR过程所依据的原理是DNA双链复制，该过程需要加入的酶是耐高温的DNA聚合酶。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是蛋白质空间结构较为复杂，改造困难。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中不存在的，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。
答案：(1)DNA双链复制 耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶) 引物 (2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难 不存在的 蛋白质
10．回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过______________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________(A.质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物)。
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入________________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是__________________。
解析：(1)该特异性探针作用的对象是蛋白质类抗原，所以该探针是抗体，可通过单克隆抗体技术获得特异性探针。用基因文库筛选某种目的基因的操作过程可以是先将基因文库中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。(2)用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测转录产物。(3)植物细胞在培养过程中往往会发生变异，筛选抗致病真菌能力强的细胞时可在培养基中加入高浓度致病真菌，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若要快速获得稳定遗传的抗病植株，可用花粉离体培养建立的细胞系用于筛选。(4)若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是胚的离体培养。
答案：(1)单克隆抗体 基因文库 (2)B (3)变异 高浓度致病真菌 花粉离体 (4)胚的离体培养
11．(2021年1月新高考8省联考·湖北卷)某实验室需构建含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的表达载体用于科学研究。相关资料如下：
(1)双链DNA的每一条链有两个末端，分别是5′端和3′端，从左到右的5′—3′DNA链是编码链，从左到右的3′—5′DNA链是模板链。
(2)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色，已知该基因的DNA编码序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′。
(3)质粒载体中含有EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Xba Ⅰ和Not Ⅰ等酶的酶切位点(这些酶各自的识别序列不同)，如下图所示。
回答下列问题：
①增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为
________________________________________________________________________。
②通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计________(填“一对”或“一个”)引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段，PCR反应一般由95 ℃热变性、55～60 ℃引物和模板配对、72 ℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是________________和________________。
③eGFP的PCR产物两端分别含有BamH Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点，构建重组表达载体时，用这两种酶酶切PCR产物和质粒载体。与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是__________________________(答一点即可)。
④将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，可观察到多个________单菌落。
解析：①增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列为5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′，则模板链序列(3′—5′DNA链)应为与之互补的另一条DNA链，故转录的mRNA碱基序列为5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′。
②通过PCR方法获得eGFP目的片段，需要两种引物分别与两条模板链结合，因此首先需要设计一对引物。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，一是防止DNA变性，二是保持Taq酶所需温度条件。③与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法可以形成不同的黏性末端，防止目的基因与质粒任意连接。④将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，能表达出抗卡那霉素的物质和绿色荧光，含有重组质粒的大肠杆菌能在该培养基上生存，因此可观察到多个含有绿色荧光的大肠杆菌单菌落。
答案：(1)5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′ (2)一对 防止DNA变性 保持Taq酶所需温度条件 (3)防止目的基因与质粒任意连接 (4)绿色荧光
12．探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段，可用于核酸分子杂交以检测目标核苷酸序列是否存在。图1是某实验小组制备的两种探针，图2是探针与目的基因杂交的示意图。请回答下列有关问题：
(1)核酸探针与目标核苷酸序列间的分子杂交遵循__________________ 。设计核苷酸序列是核酸探针技术关键步骤之一，图1所示的两种核酸探针(探针2只标注了部分碱基序列)都不合理，原因是探针1______________________，导致特异性差；而探针2____________________________，导致探针失效。
(2)cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。制备cDNA探针时，首先需提取、分离获得________作为模板，在________的催化下合成cDNA探针。利用制备好的β珠蛋白基因的cDNA探针与β珠蛋白基因杂交后，出现了如图2中甲、乙、丙、丁等所示的“发夹结构”，原因是______________________ 。
(3)探针常用于基因工程的检测，如基因工程中利用乳腺生物反应器生产α 抗胰蛋白酶，应将α 抗胰蛋白酶基因与______________________的启动子重组在一起，导入哺乳动物的________中，再利用SRY基因(Y染色体上的性别决定基因)探针进行检测，将检测反应呈________(填“阳”或“阴”)性的胚胎进行移植培养。
解析：(1)核酸探针是单链DNA分子，其与目标核苷酸序列间的分子杂交遵循碱基互补配对原则。图1中探针1碱基序列过短，特异性差；探针2自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效，因此这两种探针都不合理。(2)cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的，该过程需要逆转录酶的催化。逆转录法合成的cDNA不含内含子，而β 珠蛋白基因中含有不表达序列，因此利用制备好的β 珠蛋白基因的cDNA探针与β 珠蛋白基因杂交后，出现了如图2中甲、乙、丙、丁等所示的“发夹结构”。(3)利用乳腺生物反应器生产α 抗胰蛋白酶时，应将α 抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，将构建好的重组DNA导入哺乳动物的受精卵中，再利用SRY探针进行检测，将检测反应呈阴性(雌性)的胚胎进行移植。
答案：(1)碱基互补配对原则 碱基序列过短 自身会出现部分碱基互补配对 (2)mRNA 逆转录酶 β 珠蛋白基因中含有内含子 (3)乳腺蛋白基因 受精卵 阴
人教(2019)生物选择性必修3（知识点+跟踪检测）
第1讲 基因工程
【课标导航】
5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的
5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具
5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤
5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质
5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质
5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
3．蛋白质工程
4．DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．实验流程
[基础微点练清]
1．判断正误
(1)海鱼的抗冻蛋白基因是培育抗冻番茄的目的基因(√)
[新人教版选择性必修3 P83“概念检测”T1(1)]
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)
(4)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(5)构建含有目的基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶(×)
[新人教版选择性必修3 P83“概念检测”T1(2)]
(6)利用乳腺生物反应器生产药物属于基因工程的应用[新人教版选择性必修3 P92“概念检测”T2B](√)
(7)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(×)
(8)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同(×)
2．下列有关限制酶的叙述正确的是( )
A．用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
解析：选B 用限制酶切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需剪切2次，水解磷酸二酯键4个；限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端均有4个碱基；切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系，则两末端也可连接。
3．(新人教版选择性必修3 P74“概念检测”T1)DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( )
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
解析：选C DNA连接酶的作用是连接末端互补的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键。
4．(新人教版选择性必修3 P74“拓展应用”T1)想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示：生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
一、基因工程的操作工具
[试考题·查欠缺]
1．(全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括__________________和________________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(90～95 ℃)使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
答案：(1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
2．(全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。
解析：(1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
[强知能·补欠缺]
(一)基因工程中两种工具酶
1．限制酶的特点与使用
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
2．DNA连接酶
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3．与DNA有关的酶的比较
比较项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
形成产物 黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 新的DNA分子 形成单链DNA
(二)基因工程中的载体
1．基因工程载体应具备的条件
(1)能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。
(2)具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。
(3)具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。
2．基因工程载体与膜载体的区别
基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
3．载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
[练题点·全过关]
1．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_____________________________________
_________________________________________。
(3)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(4)基因工程中除质粒外，________和________也可作为载体。
解析：(1)当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。(2)为使载体与目的基因相连，不同的限制性核酸内切酶应该切出相同的黏性末端。(3)反转录是指以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR(多聚酶链式反应)。(4)基因工程中可以作为载体的除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
答案：(1)黏性末端 平末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
(3)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR
(4)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
2．(2021年1月新高考8省联考·福建卷，节选)阅读下列材料，完成有关问题。
材料：在全球气候变暖和水资源缺乏加剧的情况下，保障我国“粮食安全”问题尤为重要。玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。
超量表达P蛋白转基因玉米的获得与鉴定
在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示；P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。
回答下列问题：
(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被____________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用__________酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。T DNA在该实验中的作用是________________________________________________________________________
__________________________。
(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入__________进行筛选，筛选出的愈伤组织________形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。
(3)据图2分析，选择a1、a2、a3玉米株系，作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究的实验材料，理由是_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)根据“驱动基因的持续转录”可知，强启动子能被RNA聚合酶识别并结合。为使P基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和P基因不被破坏，故应优先选用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。T DNA在该实验中的作用是将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞的染色体DNA上。(2)由图1可知，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T DNA上，可以随T DNA整合到玉米细胞的染色体上，故将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。(3)据图2分析，a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表达量显著高于野生型玉米，故可以选择a1、a2、a3玉米株系，作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究的实验材料。
答案：(1)RNA聚合酶 BamH Ⅰ和Sac Ⅰ 将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上 (2)潮霉素 (再)分化 (3)a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表达量显著高于野生型玉米
二、基因工程的基本操作程序
[试考题·查欠缺]
1．(2021年1月新高考8省联考·江苏卷)啤酒生产需经过制麦、糖化、发酵等主要环节。糖化主要是将麦芽中的淀粉等有机物水解为小分子的过程。主要工艺流程如下图所示，请回答下列问题：
(1)大麦是啤酒发酵的重要碳源，针对制麦及糖化步骤，下列说法正确的有_________(填序号)。
①大麦萌发时仅产生淀粉酶，几乎不产生蛋白酶
②用赤霉素处理大麦，可诱导淀粉酶的合成
③酵母不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖
④糖化采用的温度越高，淀粉水解速度越快
(2)啤酒发酵时具有活力的酵母需达到一定的数量，故在菌种活化的过程中，需定时取样，检测酵母的生长状况。若某次样品经2次10倍稀释后，经台盼蓝染色(体积不计)，在25×16型血细胞计数板上计数_________色细胞，5个中格中的细胞数为244个，该样品中活酵母细胞的密度为_________个细胞/mL。
(3)敲除酿酒酵母中的蛋白酶基因，减少发酵液中蛋白的水解，有助于增强啤酒泡沫的稳定性，从而改善啤酒的品质。以下是某科研小组的实验：
①已知编码酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列如下(为非模板链)：
编码该酶的mRNA，起始端的三个密码子依次为______，终止密码子为________。
②Cas9蛋白可在人为设定的RNA序列(sgRNA)引导下，在选定位点切断相应的DNA链(如下图)，在DNA自我连接的修复过程中产生突变。DNA序列中含NGG的位点具有较高的编辑效率(N为任意碱基)。
上述PEP4序列虚线框中有________处可作为Cas9的优选剪切位点。Cas9的剪切位点在其NGG识别位点的________________(填“5′”或“3′”)侧。
③用酪蛋白固体培养基筛选突变体，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周围形成透明圈。需要筛选透明圈________的菌落，表明其蛋白酶活性__________。
解析：(1)大麦萌发时会产生淀粉酶、蛋白酶等，①错误；赤霉素处理大麦，可诱导淀粉酶的合成，促进种子萌发，②正确；酵母细胞呼吸的底物为葡萄糖，不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖，③正确；酶的催化需要适宜的温度，糖化采用的温度过高，会影响酶的活性，使淀粉水解速度变慢，④错误。(2)细胞膜具有选择透过性，台盼蓝不能进入活细胞，染色后用血细胞计数板计数时应对无色细胞进行计数，若某次样品经2次10倍稀释后，在25×16型血细胞计数板上计数，5个中格中的细胞数为244个，则该样品中活酵母细胞的密度为244÷5×25÷0.1×102×103＝1.22×109个/mL。(3)①已知编码酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列为(为非模板链)：
5′ ATGTTCAGCTTCAAAGCATTATTGCCATTGGCCTTG
TTGTGGTGAGCGCC……CAATTTGA 3′，模板链与非模板链方向相反，RNA 5′端为起始端，起始端的三个密码子依次为AUG、UUC、AGC，终止密码子为UGA。②DNA序列中含NGG的位点具有较高的编辑效率(N为任意碱基)。根据PEP4序列虚线框中的碱基序列，有4处可作为Cas9的优选剪切位点。据图可知，Cas9的剪切位点在其NGG识别位点的3′侧。③敲除酿酒酵母中的蛋白酶基因，减少发酵液中蛋白的水解，有助于增强啤酒泡沫的稳定性，从而改善啤酒的品质。用酪蛋白固体培养基筛选突变体，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周围形成透明圈。因此需要筛选透明圈较小的菌落，表明其蛋白酶活性较低。
答案：(1)②③ (2)无 1.22×109 (3)①AUC、UUC、ACC UGA ②4 3′ ③小 较低
2．(2018·天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加______________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。
解析：(1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。(4)不具有感染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。
答案：(1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)细胞
3．(2018·江苏高考有改动)为生产具有特定性能的α 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α 淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间
⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α 淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4 KH2PO4 50 mmol/L Tris HCl 50 mmol/L Gly NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相对活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
根据上述实验结果，初步判断该α 淀粉酶活性最高的条件为________________________________________________________________________。
解析：(1)利用PCR技术扩增α 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α 淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris HCl。
答案：(1)基因组DNA (2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 (3)② ⑥ (4)8 13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris HCl
[强知能·补欠缺]
1．获取目的基因的方法
(1)几种获取目的基因方法的比较
(2)诠释PCR技术
①PCR原理：DNA复制原理，即：
②PCR反应过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
③结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2．基因表达载体的组成
目的基因 能够控制特定性状
启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
终止子 RNA聚合酶脱离部位，终止转录
标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
4．目的基因检测与鉴定的方法
[练题点·全过关]
1．为生产高效价疫苗和简化计划免疫程序，科学家研制出基因工程乙肝－百白破(rHBDTP)四联疫苗，经各项检测均符合rHBDTP四联疫苗制检规程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌的四种类毒素。请分析回答下列问题：
(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应________，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列________(填“相同”或“不同”)。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用__________________，然后通过________大量扩增，此技术的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
(3)把目的基因导入受体细胞时，科学家采用了改造后的腺病毒作为载体，写出选它的理由：________________________________________________(写出2点)。
(4)研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的_________数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，二次免疫的特点是________________，免疫预防作用更强。
解析：(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应mRNA，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列不同。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用化学方法人工合成，然后通过PCR技术大量扩增。(3)改造后的腺病毒有多个限制酶切割位点、有标记基因，且能自主复制，因此可作为载体将目的基因导入受体细胞。(4)将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸利用的是蛋白质工程的原理，基本流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的记忆细胞数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，二次免疫的特点是短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞，免疫预防作用更强。
答案：(1)mRNA 不同 (2)化学方法人工合成 PCR技术 (3)能自主复制；有多个限制酶切割位点、有标记基因 (4)从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因) (5)记忆细胞 短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞
2．(2020·北京高考)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
(1)纤维素属于________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是____________。
(2)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列相同，这是因为________________________________________________________________________。
(3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________________________。
(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为_____________________________________________________________________。
(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用。(举一例)
解析：(1)纤维素是由葡萄糖聚合形成的多糖，所以纤维素经过酶的催化作用可降解为葡萄糖。(2)一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性。由于密码子具有简并性，即使克隆得到的C1酶基因序列与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列仍相同。(3)根据题干信息，C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，根据质粒上启动子的方向可判断酶切位点1对应的酶为BamHⅠ，而酶切位点2对应的酶为SmaⅠ。(4)比较图2中三组的实验结果可知，工程菌降解纤维素的能力最强，对照组2次之，对照组1中纤维素含量最高，由此判断，对照组2接种了降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌(B菌)。(5)该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以用该工程菌降解秸秆，以减少秸秆燃烧带来的环境污染。
答案：(1)多 葡萄糖 (2)密码子具有简并性 (3)BamHⅠ、Sma Ⅰ(顺序不能调换) (4)接种降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌(B菌) (5)降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的环境污染。
三、基因工程的应用与蛋白质工程
[试考题·查欠缺]
1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
2．(2019·海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是________________________________________________________________________。
解析：(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，T DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要将Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
答案：(1)mRNA 逆转录酶 PCR (2)T DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
3．(2020·山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是__________________________________________________________
________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录(或反转录)，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，3个突变品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
[强知能·补欠缺]
1．基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。
(3)比较基因治疗与基因诊断
原理 操作过程 进展
基因治疗 基因表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病) 临床实验
基因诊断 碱基互补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 临床应用
2．蛋白质工程
(1)流程图
(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
3．蛋白质工程与基因工程的关系
蛋白质工程 基因工程
区 别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
[练题点·全过关]
1．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质。下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“手术刀”能识别的序列和切点是，请回答下列问题：
(1)从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因的酶是________，人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是____________等。
(2)请写出质粒被切割形成黏性末端的过程。
(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是____________________________________，“插入”时用的工具是________，其种类有________________________________________________________________________等。
解析：(1)限制酶可以识别并切割特定的脱氧核苷酸序列，可用于从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因。“切下”的羊蛋白质基因，使用DNA连接酶将其与载体缝合，然后“插入”到羊的染色体中。 (2)图示的限制酶识别的序列为—GGATCC—，并且在G与G之间切开，因此形成的黏性末端为反向重复的，其过程见答案。(3)羊的染色体的主要成分是DNA和蛋白质，其中DNA上的基因与人体蛋白质基因的结构是相同的，因此人体蛋白质基因能“插入”到羊的染色体内。“插入”时用的工具是载体，其种类有质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等。
答案：(1)限制酶 DNA连接酶
(2)
(3)基因的结构相同 载体 质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物
2．(2019·江苏高考)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为，EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为__________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________________、____________________________。
平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，形成P2，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P2连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确(反向插入)时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，无法进行扩增鉴定，因此只能选用乙、丙作为引物，通过PCR鉴定目的基因是否插入正确。若扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
答案：(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙、丙 目的基因反向连接
四、DNA的粗提取与鉴定
[试考题·查欠缺]
1．(2020·海南高考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
解析：选A 羊是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，因此羊的成熟红细胞不能作为提取DNA的材料，A错误；提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是溶解细胞膜，而食盐的作用是溶解DNA，B正确；冷却的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，C正确；在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，D正确。
2．(2019·江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析：选A 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。
[强知能·补欠缺]
1．DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异
比较项目 DNA 蛋白质
溶解性 2 mol/L NaCl溶液中 溶解 析出
0.14 mol/L NaCl溶液中 析出 溶解
酒精溶液中 析出 溶解
耐受性 蛋白酶 无影响 水解
高温 80 ℃以上变性 不能忍受60～80 ℃的高温
2．DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、3、4”
加蒸馏水2次 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂； ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤3次 ①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液； ②滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)； ③过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质； ②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出； ③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物； ④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
3．DNA粗提取实验中的三个注意点
(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
(2)因DNA容易被玻璃容器吸附，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，减少提取过程中DNA的损失。
(3)每次用玻璃棒搅拌时都要沿同一方向，防止打碎DNA分子。
[练题点·全过关]
1．关于还原糖、蛋白质和DNA的鉴定实验，下列叙述正确的是( )
A．在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色
B．在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色
C．提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液
D．将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色
解析：选D 甘蔗茎的组织样液富含蔗糖，而蔗糖属于非还原糖，且不能用斐林试剂检测，A错误；大豆种子中富含蛋白质，先后加入双缩脲试剂A液和B液摇匀后，液体由蓝色变为紫色，B错误；提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤纸上的黏稠物，留下滤液，C错误；将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂并水浴加热，溶液由无色变为蓝色，D正确。
2．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，对DNA进行鉴定时，做如下操作：
步骤 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4 mL二苯胺，混匀 加4 mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据如图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液的颜色为________________________________________________________________________
______________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是____________________，同时说明DNA对高温有较强的__________________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与___________________________________
_____________________________________有关。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液变蓝色 DNA在沸水浴的条件下遇二苯胺会变成蓝色
(2)基本不变(不呈蓝色)
(3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照
(5)DNA(丝状物)的多少
科学探究——探讨基因工程操作中限制酶的选择方法
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
3．根据Ti质粒的TDNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
[素养训练]
1．(2021·泉州月考)图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。据此判断下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是( )
A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和HindⅢ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
解析：选D PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图乙中引物甲和引物丙，A正确；选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确；将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中，需要用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，C正确；在构建基因表达载体时，使用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割质粒，氨苄青霉素抗性基因已被破坏，因此氨苄青霉素抗性基因在受体细胞中不能表达，D错误。
2．人体内的t PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t PA会诱发颅内出血，其原因在于tPA与纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的tPA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良tPA蛋白(注：如图表示相关的目的基因、载体、限制酶识别序列和切割位点，pCLY11为质粒，新霉素为抗生素)。请回答下列问题：
(1)以上制造出性能优异的改良tPA蛋白的过程被称为____________工程。
(2)已知人tPA基因序列已测出，且第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的模板链碱基序列为AGA，因此要获得改造后的目的基因最好采用____________________方法获得。
(3)若tPA改良基因的黏性末端如图所示，那么需选用限制酶XmaⅠ和__________切开质粒pCLY11，才能与tPA改良基因高效连接。在基因工程中，最核心的一步为________________________________。
(4)一般选择在未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，目的是__________________________________________。在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是______________________________________________，这时需选择呈__________色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌株。
解析：(1)在原有的tPA蛋白基础上改良蛋白质结构，属于蛋白质工程。(2)由于tPA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化学方法人工合成的方法获得目的基因。(3)目的基因的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知所使用的限制酶为XmaⅠ和BglⅡ，要想把目的基因与载体拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此载体也需要XmaⅠ和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建。(4)选择未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，这些细胞没有新霉素的抗性，当其导入重组质粒后，质粒上的标记基因使得大肠杆菌具有新霉素抗性，这样可以选择导入质粒pCLY11的大肠杆菌；由于标记基因存在于原有质粒上，若未连目的基因的质粒导入到大肠杆菌中，这些大肠杆菌也可以获得新霉素的抗性；而区分重组质粒和原有质粒的一个标志可以观察mlacZ基因的表达情况，由于重组质粒拼接了目的基因，破坏了mlacZ基因，因此在重组质粒中该基因不表达，菌落呈现白色，而导入非重组质粒的大肠杆菌由于该基因保存完整，可以表达，所以菌落呈现蓝色。
答案：(1)蛋白质 (2)化学方法人工合成 (3)BglⅡ 基因表达载体的构建 (4)以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌 含有未连目的基因质粒的大肠杆菌也可以在这种培养基上生长 白
一、对点练小题，落实主干知识
1．如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( )
A．限制酶、解旋酶、DNA连接酶
B．解旋酶、限制酶、DNA连接酶
C．解旋酶、DNA连接酶、限制酶
D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶
解析：选B ①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。
2．如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在乙图中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
解析：选C 由图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为：GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为：GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
3．下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B．检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术
C．目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的
D．如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子
解析：选A 目的基因在真核细胞中稳定遗传的关键是目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA上，A错误；通过抗原抗体杂交可以检测目的基因是否翻译成了蛋白质，检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术，B正确；目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的，如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，C正确；如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子，D正确。
4．下列是“肝脏细胞DNA粗提取”实验的两个关键操作步骤，相关叙述错误的是( )
A．步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定
B．步骤1中，冰浴处理的主要原理是低温下DNA酶容易变性
C．步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀
D．步骤2中，离心后应取上清液，因为DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比较大
解析：选B 步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定，A正确；低温不会使酶变性失活，只能降低酶的活性，B错误；步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀，C正确；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度比较大，因此加固体NaCl使溶液浓度达到2 mol/L后再离心过滤取上清液，D正确。
5．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C 目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上。
6．若要利用某目的基因(图甲)和质粒载体(图乙)构建重组DNA(图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
解析：选D 根据题意并分析图示可知，只有EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体，在构建的重组DNA中，RNA聚合酶在插入目的基因上的移动方向才与图丙相同。
二、系统练大题，强化科学思维
7．科学家将拟南芥的抗寒基因(CBFl)，转入香蕉以获得抗寒的香蕉品种。如图是某质粒载体上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ四种限制酶的切割位点示意图。据图回答问题：
(1)在该实验中为构建基因表达载体，用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后，对质粒载体进行切割的限制酶是________________，理由是________________________________________________________________________。
(2)连接CBFl基因到该质粒载体后，作为基因表达载体的组成还必须有__________________。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是__________________________。
(3)为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含______________的培养基进行筛选。
(4)科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行______________处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果__________________________________，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。
解析：(1)在基因工程中，用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端，所以和含目的基因的DNA一样，质粒也应使用SacⅠ、XbaⅠ进行切割。(2)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、标记基因、目的基因等。香蕉细胞是植物细胞，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(3)据图分析可知，质粒上的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，所以为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。(4)根据题干信息已知目的基因是抗寒基因，所以科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行低温处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果实验组的抗寒能力明显高于对照组，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。
答案：(1)SacⅠ、XbaⅠ 用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端 (2)启动子和终止子 农杆菌转化法 (3)氨苄青霉素 (4)低温 实验组的抗寒能力明显高于对照组
8．某实验小组利用转基因技术培育耐盐水稻，如图1表示含有耐盐基因的外源DNA分子，图2表示质粒，其上含有BamHⅠ、SmaⅠ和HindⅢ三种限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
(1)分析上图可知，欲构建重组DNA分子，应选用________________两种限制酶切割质粒和外源DNA分子，使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)题(1)中不使用另外一种限制酶切割的原因是__________________，题(1)中构建成功的重组质粒若用该酶切割能产生________种不同的DNA片段。
(3)质粒中抗性基因的作用是__________________。成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含______(填“氨苄青霉素”或“四环素”)的培养基中进行培养。
(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)外源DNA和质粒上都含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的识别序列和切割位点，但限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，应该选用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA分子；使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒可防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接。(2)构建成功的重组质粒含有3个限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点，因此若用该酶切割构建成功的重组质粒能产生3种不同的DNA片段。(3)质粒中抗性基因的作用是筛选和鉴定目的基因；构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，但氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含四环素的培养基中进行培养。(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接 (2)SmaⅠ会破坏目的基因 3 (3)筛选和鉴定目的基因 四环素 (4)将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长
9．科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶基因对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是______________，该过程需要加入的酶是________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中________(填“存在的”或“不存在的”)，PCR定点突变技术属于________工程的范畴。
解析：(1)PCR过程所依据的原理是DNA双链复制，该过程需要加入的酶是耐高温的DNA聚合酶。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是蛋白质空间结构较为复杂，改造困难。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中不存在的，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。
答案：(1)DNA双链复制 耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶) 引物 (2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难 不存在的 蛋白质
10．回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过______________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________(A.质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物)。
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入________________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是__________________。
解析：(1)该特异性探针作用的对象是蛋白质类抗原，所以该探针是抗体，可通过单克隆抗体技术获得特异性探针。用基因文库筛选某种目的基因的操作过程可以是先将基因文库中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。(2)用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测转录产物。(3)植物细胞在培养过程中往往会发生变异，筛选抗致病真菌能力强的细胞时可在培养基中加入高浓度致病真菌，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若要快速获得稳定遗传的抗病植株，可用花粉离体培养建立的细胞系用于筛选。(4)若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是胚的离体培养。
答案：(1)单克隆抗体 基因文库 (2)B (3)变异 高浓度致病真菌 花粉离体 (4)胚的离体培养
11．(2021年1月新高考8省联考·湖北卷)某实验室需构建含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的表达载体用于科学研究。相关资料如下：
(1)双链DNA的每一条链有两个末端，分别是5′端和3′端，从左到右的5′—3′DNA链是编码链，从左到右的3′—5′DNA链是模板链。
(2)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色，已知该基因的DNA编码序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′。
(3)质粒载体中含有EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Xba Ⅰ和Not Ⅰ等酶的酶切位点(这些酶各自的识别序列不同)，如下图所示。
回答下列问题：
①增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为
________________________________________________________________________。
②通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计________(填“一对”或“一个”)引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段，PCR反应一般由95 ℃热变性、55～60 ℃引物和模板配对、72 ℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是________________和________________。
③eGFP的PCR产物两端分别含有BamH Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点，构建重组表达载体时，用这两种酶酶切PCR产物和质粒载体。与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是__________________________(答一点即可)。
④将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，可观察到多个________单菌落。
解析：①增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列为5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′，则模板链序列(3′—5′DNA链)应为与之互补的另一条DNA链，故转录的mRNA碱基序列为5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′。
②通过PCR方法获得eGFP目的片段，需要两种引物分别与两条模板链结合，因此首先需要设计一对引物。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，一是防止DNA变性，二是保持Taq酶所需温度条件。③与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法可以形成不同的黏性末端，防止目的基因与质粒任意连接。④将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，能表达出抗卡那霉素的物质和绿色荧光，含有重组质粒的大肠杆菌能在该培养基上生存，因此可观察到多个含有绿色荧光的大肠杆菌单菌落。
答案：(1)5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′ (2)一对 防止DNA变性 保持Taq酶所需温度条件 (3)防止目的基因与质粒任意连接 (4)绿色荧光
12．探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段，可用于核酸分子杂交以检测目标核苷酸序列是否存在。图1是某实验小组制备的两种探针，图2是探针与目的基因杂交的示意图。请回答下列有关问题：
(1)核酸探针与目标核苷酸序列间的分子杂交遵循__________________ 。设计核苷酸序列是核酸探针技术关键步骤之一，图1所示的两种核酸探针(探针2只标注了部分碱基序列)都不合理，原因是探针1______________________，导致特异性差；而探针2____________________________，导致探针失效。
(2)cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。制备cDNA探针时，首先需提取、分离获得________作为模板，在________的催化下合成cDNA探针。利用制备好的β珠蛋白基因的cDNA探针与β珠蛋白基因杂交后，出现了如图2中甲、乙、丙、丁等所示的“发夹结构”，原因是______________________ 。
(3)探针常用于基因工程的检测，如基因工程中利用乳腺生物反应器生产α 抗胰蛋白酶，应将α 抗胰蛋白酶基因与______________________的启动子重组在一起，导入哺乳动物的________中，再利用SRY基因(Y染色体上的性别决定基因)探针进行检测，将检测反应呈________(填“阳”或“阴”)性的胚胎进行移植培养。
解析：(1)核酸探针是单链DNA分子，其与目标核苷酸序列间的分子杂交遵循碱基互补配对原则。图1中探针1碱基序列过短，特异性差；探针2自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效，因此这两种探针都不合理。(2)cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的，该过程需要逆转录酶的催化。逆转录法合成的cDNA不含内含子，而β 珠蛋白基因中含有不表达序列，因此利用制备好的β 珠蛋白基因的cDNA探针与β 珠蛋白基因杂交后，出现了如图2中甲、乙、丙、丁等所示的“发夹结构”。(3)利用乳腺生物反应器生产α 抗胰蛋白酶时，应将α 抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，将构建好的重组DNA导入哺乳动物的受精卵中，再利用SRY探针进行检测，将检测反应呈阴性(雌性)的胚胎进行移植。
答案：(1)碱基互补配对原则 碱基序列过短 自身会出现部分碱基互补配对 (2)mRNA 逆转录酶 β 珠蛋白基因中含有内含子 (3)乳腺蛋白基因 受精卵 阴