3.1 重组DNA技术的基本工具（第2课时）(共30张PPT)-2022-2023学年高二生物课件（人教版2019选择必修3）

(共30张PPT)
（第二课时）
若把两种异源DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
T
A
T
A
EcoRI
EcoRI
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
何酶能把这两缺口连接起来？
DNA连接酶──“分子缝合针”、“基因的针线”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。使之成为一个完整
的DNA分子。
作用：
作用部位：
磷酸二酯键
注意： DNA连接酶是把缺口的磷酸二脂键连接，而不是氢键（氢键的形成不需酶的催化）
类型 E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只缝合_________ 缝合________和_____
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
连接酶的种类：
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
两者都能催化形成磷酸二酯键
DNA聚合酶是在DNA复制过程中以DNA的一条链作模板，只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键而形成DNA的一条子链
DNA连接酶是在基因工程中将两个DNA片段之间形成磷酸二酯键而形构成重组DNA分子
DNA的连接酶、限制酶、聚合酶、解旋酶、水解酶
项目 作用部位 作用对象 作用结果
连接酶
限制酶
聚合酶
解旋酶
水解酶
磷酸
二酯键
磷酸
二酯键
磷酸
二酯键
磷酸
二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧核苷酸
DNA
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将两个DNA片段连接成完整DNA分子
切割双链DNA分子
将单个脱氧核苷酸连到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
1：要让一个从甲生物细胞内取出来的外源基因怎样才能导入在乙生物体内(受体细胞)进行表达
能将外源基因送入细胞的工具就是运载体
2：作为运载体，你认为该有的作用有哪些？
作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。
利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
基因进入受体细胞的载体——分子运输车
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
作用：
通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒等可作载体
种类：
病毒
载体——质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
真正用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的！
质粒都可用作载体吗？
运载体需具备的条件
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因；
③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞；
④对受体细胞无害、易分离
思考讨论——重组DNA分子
请你根据图中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
若制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得
不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上
1.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是 ( 　)
A.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
B
2.下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行
B
3.质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是(　　)
A.质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上
B.质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器.基因工程使用的质粒一定含有标记基因和复制原点
D.质粒上碱基数量之间存在A＋G＝U＋C
C
1.实验原理
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA的粗提取与鉴定
2.材料用具
新鲜的菜花、香蕉、洋葱、菠菜、猪肝等含有DNA的生物
研磨液、体积分数为95％的酒精、
2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
3.方法步骤
（1）通过研磨释放DNA
称取约5g切碎的菜花
加10mL研磨液充分研磨
研磨目的：破碎细胞，使核物质易溶在研磨液中
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中
在4℃冰箱中放置几
分钟后再取上清液。
低温放置的作用可抑制酶的活性以阻止DNA降解及运动，使之易形成沉淀析出
（3）冷却酒精析出DNA
上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水
（4）DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加
入4mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
分析1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
分析2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
分析3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
实验结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌
时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，
否则二苯胺变成浅蓝色，
影响鉴定效果。
方法一：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少，对同种材料采用不同的方法。以多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，比较哪种实验材料、哪种方法的效果更好。
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
1.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( )
A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色
2.DNA析出与鉴定过程中，会出现白色丝状物，用玻璃棒搅拌时为什么要沿一个方向轻轻搅拌
A、为了省力 B、加快蛋白质的析出
C、为了加大DNA的溶解度
D、防止DNA结构被破坏
3.在DNA析出与鉴定过程中加入酒精的目的是
A、溶解DNA B、除去DNA中所有杂质
C、析出DNA D、稀释溶液降低浓度
D
C
D
4.关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述哪一个是正确的（ ）
A随着NaCl溶液浓度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大
B随着NaCl溶液浓度的减小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小
C DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关
D当NaCl溶液的浓度为0.14M时，DNA的溶解度最低
D
5.下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验原理的叙述正确的是 （ ）
A．DNA在NaCl溶液中的溶解度，随NaCl溶液浓度的降低而减小
B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA
C．DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于所有有机溶剂
D．在沸水中，DNA遇二苯胺会出现紫色反应
B
6.为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
加2mol/L的NaCl溶液的目的：
溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。
加蒸馏水的目的：
除低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。