3.2 基因工程的操作程序(共17张PPT)（第2课时）-2022-2023学年高二生物课件（人教版2019选择必修3）
文档属性
| 名称 | 3.2 基因工程的操作程序(共17张PPT)（第2课时）-2022-2023学年高二生物课件（人教版2019选择必修3） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 49.0MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-01-10 17:55:52 | ||
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文档简介
(共17张PPT)
基因工程的
基本操作程序
（第二课时）
4.利用PCR扩增目的基因
穆里斯等人发明1993年获诺贝尔奖
PCR：
_______________的缩写
实质：
DNA半保留复制
是一项在______提供参与DNA复制的________与_________，对________________________进行_____________的技术。
原理：
聚合酶链式反应
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
贡献：
在DNA复制 中的作用 细胞内的 DNA复制 PCR
（体外DNA复制）
打开DNA双链
提供DNA 复制的模板
合成DNA 子链的原料
催化合成 DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧
核苷酸
DNA聚合酶
引物
高温
含目的基因的DNA母链
4种脱氧核苷酸（dNTP）
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶)
人工合成的引物
含Mg2+的缓冲溶液
（1）DNA复制所需的基本条件:
（2）PCR条件
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
①DNA模板（需含有目的基因）
②分别与模板DNA相结合的2种引物
③四种脱氧核苷酸
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
⑥能严格控制温度的温控设备
（2）PCR反应过程
变性
当温度超过_____时，双链DNA受热变性，断开氢键，形成___________
90℃
DNA单链
复性
当温度下降到______左右，___种引物通过______________与两条单链DNA结合；
50℃
2
碱基互补配对
延伸
当温度上升到_____左右，以_________为模板，4种脱氧核苷酸在_____________________酶的作用下，根据______________原则合成新的DNA链，该DNA链的延伸方向是_______________。
72℃
DNA单链
耐高温的DNA聚合(Taq）
碱基互补配对
5’端 3’端
PCR过程中，每个循环得到的产物都将作为下一个循环的模板，因此经过n次循环，1个DNA分子将被扩增为_____个，成______式扩增
2n
指数
PCR过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
PCR技术扩增与DNA复制的比较
异同 PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增
①PCR利用了DNA的热变
性原理，通过调节温度
来控制DNA双链的解聚
与结合；PCR仪实质上
就是一台能够自动调控
温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷
②迁移动力与方向：
在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2．琼脂糖凝胶电泳
4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
二、材料用具
三、方法步骤
1．用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2．待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。
3．参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合
4．用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀
5．将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
6．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
7．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阴阳极间的距离来设定电压(1～5V/cm)。待指示剂前沿移近凝胶边时停止
8．取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1.你是否成功扩增
出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp
四、结果分析与评价
若扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？若不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因
若扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
基因工程的
基本操作程序
（第二课时）
4.利用PCR扩增目的基因
穆里斯等人发明1993年获诺贝尔奖
PCR：
_______________的缩写
实质：
DNA半保留复制
是一项在______提供参与DNA复制的________与_________，对________________________进行_____________的技术。
原理：
聚合酶链式反应
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
贡献：
在DNA复制 中的作用 细胞内的 DNA复制 PCR
（体外DNA复制）
打开DNA双链
提供DNA 复制的模板
合成DNA 子链的原料
催化合成 DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧
核苷酸
DNA聚合酶
引物
高温
含目的基因的DNA母链
4种脱氧核苷酸（dNTP）
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶)
人工合成的引物
含Mg2+的缓冲溶液
（1）DNA复制所需的基本条件:
（2）PCR条件
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
①DNA模板（需含有目的基因）
②分别与模板DNA相结合的2种引物
③四种脱氧核苷酸
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
⑥能严格控制温度的温控设备
（2）PCR反应过程
变性
当温度超过_____时，双链DNA受热变性，断开氢键，形成___________
90℃
DNA单链
复性
当温度下降到______左右，___种引物通过______________与两条单链DNA结合；
50℃
2
碱基互补配对
延伸
当温度上升到_____左右，以_________为模板，4种脱氧核苷酸在_____________________酶的作用下，根据______________原则合成新的DNA链，该DNA链的延伸方向是_______________。
72℃
DNA单链
耐高温的DNA聚合(Taq）
碱基互补配对
5’端 3’端
PCR过程中，每个循环得到的产物都将作为下一个循环的模板，因此经过n次循环，1个DNA分子将被扩增为_____个，成______式扩增
2n
指数
PCR过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
PCR技术扩增与DNA复制的比较
异同 PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增
①PCR利用了DNA的热变
性原理，通过调节温度
来控制DNA双链的解聚
与结合；PCR仪实质上
就是一台能够自动调控
温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷
②迁移动力与方向：
在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2．琼脂糖凝胶电泳
4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
二、材料用具
三、方法步骤
1．用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2．待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。
3．参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合
4．用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀
5．将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
6．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
7．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阴阳极间的距离来设定电压(1～5V/cm)。待指示剂前沿移近凝胶边时停止
8．取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1.你是否成功扩增
出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp
四、结果分析与评价
若扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？若不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因
若扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。