3.2 基因工程的操作程序(共51张PPT)（第1课时）-2022-2023学年高二生物课件（人教版2019选择必修3）
文档属性
| 名称 | 3.2 基因工程的操作程序(共51张PPT)（第1课时）-2022-2023学年高二生物课件（人教版2019选择必修3） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 83.4MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-01-10 17:58:56 | ||
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文档简介
(共51张PPT)
基因工程的
基本操作程序
（第一课时）
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉需要哪步骤？
培育转基因抗虫棉主要需要的四个步骤：
第二步：基因表达载体的构建
第一步：目的基因的筛选与获取
第三步：将目的基因导入受体细胞
第四步：目的基因的检测与鉴定
什么是基因？基因的结构和功能又如何？
基因的结构与功能
基因的结构
基因是控制生物性状的结构和功能单位，是具有遗传效应的DNA片段
注意：基因间区是DNA上不具有遗传效应的片段，指基因与基因之间的间隔序列
基因的功能是什么？其结构如何与功能相适应？
基因的功能
通过复制而传递遗传信息给子代
两个相同的双螺旋DNA分子
DNA的两条链（母链）
四种游离的脱氧核苷酸
一般由ATP
解旋酶、DNA聚合酶
半保留复制、边解旋边复制
原因：
结果：
特点：
DNA复制
模板：
原料：
能量：
酶：
条件
具双螺旋结构；遵循碱基互补配对原则
通过控制蛋白质的合成使遗传信息得以表达
驱动转录的关键是RNA聚合酶的识别及结合部位（位于“启动子”）；而转录止于“终止子”
翻译开始于其模板链mRNA上的起始密码子（2个）而结束于终于密码子（3个）
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列 (如启动子、终止子）
能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质
位于编码区上游，RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录
位于编码区下游，终止转录
能够编码蛋白质的序列
不能编码蛋白质的序列
真核基因的非编码序列
非编码区
编码区的内含子
异同 原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的__________和具有调控作用的__________区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
阅读教材，回答问题：
（1）什么是目的基因？为什么培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt基因？
（2）Bt基因的杀虫机理是怎样的？对人畜有害吗？
（3）科学家是如何筛选得到合适的目的基因的？
第一步：获取目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
1.目的基因
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
实例
既可来自生物体本身， 也可来自不同生物体
目的基因来源：
思考1：为什么培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt基因？
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细胞的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
思考2：Bt基因的杀虫机理是怎样的？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
思考3：抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
2.筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年的历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关。科学家不仅掌握了Bt 基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列
数据库（GenBank）、序列比对工
具（如BLAST）等的应用，越来越
多的基因的结构和功能为人们所知，
为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
3.目的基因的获取方法
利用PCR获取和扩增目的基因
从基因文库中获取
通过DNA合成仪直接合成
4.利用PCR扩增目的基因
穆里斯等人发明1993年获诺贝尔奖
PCR：
_______________的缩写
实质：
DNA半保留复制
是一项在______提供参与DNA复制的________与_________，对________________________进行_____________的技术。
原理：
聚合酶链式反应
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
贡献：
在DNA复制 中的作用 细胞内的 DNA复制 PCR
（体外DNA复制）
打开DNA双链
提供DNA 复制的模板
合成DNA 子链的原料
催化合成 DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧
核苷酸
DNA聚合酶
引物
高温
含目的基因的DNA母链
4种脱氧核苷酸（dNTP）
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶)
人工合成的引物
含Mg2+的缓冲溶液
（1）DNA复制所需的基本条件:
（2）PCR条件
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
①DNA模板（需含有目的基因）
②分别与模板DNA相结合的2种引物
③四种脱氧核苷酸
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
⑥能严格控制温度的温控设备
（2）PCR反应过程
变性
当温度超过_____时，双链DNA受热变性，断开氢键，形成___________
90℃
DNA单链
复性
当温度下降到______左右，___种引物通过______________与两条单链DNA结合；
50℃
2
碱基互补配对
延伸
当温度上升到_____左右，以_________为模板，4种脱氧核苷酸在_____________________酶的作用下，根据______________原则合成新的DNA链，该DNA链的延伸方向是_______________。
72℃
DNA单链
耐高温的DNA聚合(Taq）
碱基互补配对
5’端 3’端
PCR过程中，每个循环得到的产物都将作为下一个循环的模板，因此经过n次循环，1个DNA分子将被扩增为_____个，成______式扩增
2n
指数
PCR过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
PCR技术扩增与DNA复制的比较
异同 PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增
①PCR利用了DNA的热变
性原理，通过调节温度
来控制DNA双链的解聚
与结合；PCR仪实质上
就是一台能够自动调控
温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷
②迁移动力与方向：
在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2．琼脂糖凝胶电泳
4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
二、材料用具
三、方法步骤
1．用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2．待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。
3．参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合
4．用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀
5．将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
6．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
7．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阴阳极间的距离来设定电压(1～5V/cm)。待指示剂前沿移近凝胶边时停止
8．取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1.你是否成功扩增
出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp
四、结果分析与评价
若扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？若不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因
若扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
——基因工程的核心
1.目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
（2）使目的基因能够表达和发挥作用
阅读P80第二段内容，思考基因表达载体由哪些部分组成？试结合P72图3—4质粒的结构画出基因表达载体模式图，标注各组成部分的名称。
第二步：基因表达载体的构建
2.基因表达载体组成及其功能
注意：目的基因必须插入到________与________之间。
终止子
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
DNA复制的起始位点
便于重组DNA分子的筛选
控制特定性状或表达特定产物
终止目的
基因的转录
启动子
3.基因表达载体构建的流程
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子
目的基因与运载体的结合
过程，实际上是不同来源的基因重组的过程
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
不同生物的导入方法各不同
转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
2.农杆菌转化法
原理：
结合视频资料，对照P81图解思考农杆菌转化过程步骤，可分哪几个阶段？
农杆菌转化过程：
________插入Ti质粒的_______中形成含目的基因的重组Ti质粒
将含目的基因的重组Ti质粒导入_________
农杆菌
目的基因
T-DNA
①构建表达载体
②转入农杆菌
目的基因插入植物细胞中的__________上
染色体DNA
③导入植物细胞
④表现出新性状的植株
愈伤组织
幼苗
新性状植株
含目的基因
的植物细胞
脱 分化
再分化
移栽
目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞
注意过程中的“两拼接”“两导入”的指代
两次拼接
两次导入
3.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
受精卵
构建基因表达载体
早期胚胎培养
获得具新性状的转基因动物
显微注射
胚胎
移植
4.将目的基因导入微生物细胞
一般先用Ca2+处理大肠杆菌,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,后再将重组的基因表达载体导入其中
检测转基因生物染色体DNA上是否插入目的基因
检测目的的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质
分子检测
抗虫鉴定
抗病鉴定
活性鉴定
个体生物学水平的鉴定
DNA分子水平
RNA分子水平
蛋白质分子水平
PCR核酸杂交检测
抗虫接种实验
抗原-抗体杂交
第四步：目的基因的检测与鉴定
核酸杂交检测法
原理：
碱基互补配对原则
过程：
③使探针和转基因生物的DNA
（或mRNA）杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中（或目的基因转录出了mRNA）
①提取转基因生物的DNA
②制作基因探针：
用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记。
抗原-抗体杂交
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若
有杂交带出现，表明目的
基因已形成蛋白质产品。
抗虫、抗病或活性鉴定
通过抗虫或抗病的接种实验。有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
获取质粒
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切
割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目
的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴
定目的基因
是否稳定维
持和表达其
遗传特性
基因工程
的基本操
作程序
1.下列关于基因的叙述中正确的是
A.基因在DNA双链上成对存在
B.基因中含有遗传密码
C.基因位于DNA分子上
D.基因由四个脱氧核糖核苷酸分子组成
C
2.有关基因工程的叙述正确的是
A.限制酶只在获得目的基因时才用
B.重组质粒的形成在细胞内完成
C.质粒都可作为运载体
D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
D
3、以下说法正确的是
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
4、不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因 D、它是环状DNA
C
D
3.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
A
4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
C
5．在受体细胞中能检测出目的基因是因为
A.目的基因上有标记
B.重组质粒能够复制
C.质粒具有某些标记基因
D.以上都不正确
C
6.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是 ( )
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
B
(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的__处，DNA连接酶作用于__处。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和_______________法。
（3）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的____________作探针进行分子杂交检测，又要用___________________方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
1、为扩大可耕地面积，
增加粮食产量，黄河三
角洲等盐碱地的开发利
用备受关注。我国科学
家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
a
a
花粉管通道法
耐盐基因
一定浓度盐水浇灌
基因工程的
基本操作程序
（第一课时）
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉需要哪步骤？
培育转基因抗虫棉主要需要的四个步骤：
第二步：基因表达载体的构建
第一步：目的基因的筛选与获取
第三步：将目的基因导入受体细胞
第四步：目的基因的检测与鉴定
什么是基因？基因的结构和功能又如何？
基因的结构与功能
基因的结构
基因是控制生物性状的结构和功能单位，是具有遗传效应的DNA片段
注意：基因间区是DNA上不具有遗传效应的片段，指基因与基因之间的间隔序列
基因的功能是什么？其结构如何与功能相适应？
基因的功能
通过复制而传递遗传信息给子代
两个相同的双螺旋DNA分子
DNA的两条链（母链）
四种游离的脱氧核苷酸
一般由ATP
解旋酶、DNA聚合酶
半保留复制、边解旋边复制
原因：
结果：
特点：
DNA复制
模板：
原料：
能量：
酶：
条件
具双螺旋结构；遵循碱基互补配对原则
通过控制蛋白质的合成使遗传信息得以表达
驱动转录的关键是RNA聚合酶的识别及结合部位（位于“启动子”）；而转录止于“终止子”
翻译开始于其模板链mRNA上的起始密码子（2个）而结束于终于密码子（3个）
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列 (如启动子、终止子）
能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质
位于编码区上游，RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录
位于编码区下游，终止转录
能够编码蛋白质的序列
不能编码蛋白质的序列
真核基因的非编码序列
非编码区
编码区的内含子
异同 原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的__________和具有调控作用的__________区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
阅读教材，回答问题：
（1）什么是目的基因？为什么培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt基因？
（2）Bt基因的杀虫机理是怎样的？对人畜有害吗？
（3）科学家是如何筛选得到合适的目的基因的？
第一步：获取目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
1.目的基因
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
实例
既可来自生物体本身， 也可来自不同生物体
目的基因来源：
思考1：为什么培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt基因？
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细胞的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
思考2：Bt基因的杀虫机理是怎样的？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
思考3：抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
2.筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年的历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关。科学家不仅掌握了Bt 基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列
数据库（GenBank）、序列比对工
具（如BLAST）等的应用，越来越
多的基因的结构和功能为人们所知，
为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
3.目的基因的获取方法
利用PCR获取和扩增目的基因
从基因文库中获取
通过DNA合成仪直接合成
4.利用PCR扩增目的基因
穆里斯等人发明1993年获诺贝尔奖
PCR：
_______________的缩写
实质：
DNA半保留复制
是一项在______提供参与DNA复制的________与_________，对________________________进行_____________的技术。
原理：
聚合酶链式反应
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
贡献：
在DNA复制 中的作用 细胞内的 DNA复制 PCR
（体外DNA复制）
打开DNA双链
提供DNA 复制的模板
合成DNA 子链的原料
催化合成 DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧
核苷酸
DNA聚合酶
引物
高温
含目的基因的DNA母链
4种脱氧核苷酸（dNTP）
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶)
人工合成的引物
含Mg2+的缓冲溶液
（1）DNA复制所需的基本条件:
（2）PCR条件
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
①DNA模板（需含有目的基因）
②分别与模板DNA相结合的2种引物
③四种脱氧核苷酸
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
⑥能严格控制温度的温控设备
（2）PCR反应过程
变性
当温度超过_____时，双链DNA受热变性，断开氢键，形成___________
90℃
DNA单链
复性
当温度下降到______左右，___种引物通过______________与两条单链DNA结合；
50℃
2
碱基互补配对
延伸
当温度上升到_____左右，以_________为模板，4种脱氧核苷酸在_____________________酶的作用下，根据______________原则合成新的DNA链，该DNA链的延伸方向是_______________。
72℃
DNA单链
耐高温的DNA聚合(Taq）
碱基互补配对
5’端 3’端
PCR过程中，每个循环得到的产物都将作为下一个循环的模板，因此经过n次循环，1个DNA分子将被扩增为_____个，成______式扩增
2n
指数
PCR过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
PCR技术扩增与DNA复制的比较
异同 PCR技术 DNA复制
相同点 原理
原料
条件
不同点 解旋
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增
①PCR利用了DNA的热变
性原理，通过调节温度
来控制DNA双链的解聚
与结合；PCR仪实质上
就是一台能够自动调控
温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷
②迁移动力与方向：
在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2．琼脂糖凝胶电泳
4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
二、材料用具
三、方法步骤
1．用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2．待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。
3．参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合
4．用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀
5．将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
6．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
7．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阴阳极间的距离来设定电压(1～5V/cm)。待指示剂前沿移近凝胶边时停止
8．取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1.你是否成功扩增
出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp
四、结果分析与评价
若扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？若不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因
若扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
——基因工程的核心
1.目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
（2）使目的基因能够表达和发挥作用
阅读P80第二段内容，思考基因表达载体由哪些部分组成？试结合P72图3—4质粒的结构画出基因表达载体模式图，标注各组成部分的名称。
第二步：基因表达载体的构建
2.基因表达载体组成及其功能
注意：目的基因必须插入到________与________之间。
终止子
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
DNA复制的起始位点
便于重组DNA分子的筛选
控制特定性状或表达特定产物
终止目的
基因的转录
启动子
3.基因表达载体构建的流程
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子
目的基因与运载体的结合
过程，实际上是不同来源的基因重组的过程
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
不同生物的导入方法各不同
转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
2.农杆菌转化法
原理：
结合视频资料，对照P81图解思考农杆菌转化过程步骤，可分哪几个阶段？
农杆菌转化过程：
________插入Ti质粒的_______中形成含目的基因的重组Ti质粒
将含目的基因的重组Ti质粒导入_________
农杆菌
目的基因
T-DNA
①构建表达载体
②转入农杆菌
目的基因插入植物细胞中的__________上
染色体DNA
③导入植物细胞
④表现出新性状的植株
愈伤组织
幼苗
新性状植株
含目的基因
的植物细胞
脱 分化
再分化
移栽
目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞
注意过程中的“两拼接”“两导入”的指代
两次拼接
两次导入
3.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
受精卵
构建基因表达载体
早期胚胎培养
获得具新性状的转基因动物
显微注射
胚胎
移植
4.将目的基因导入微生物细胞
一般先用Ca2+处理大肠杆菌,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,后再将重组的基因表达载体导入其中
检测转基因生物染色体DNA上是否插入目的基因
检测目的的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质
分子检测
抗虫鉴定
抗病鉴定
活性鉴定
个体生物学水平的鉴定
DNA分子水平
RNA分子水平
蛋白质分子水平
PCR核酸杂交检测
抗虫接种实验
抗原-抗体杂交
第四步：目的基因的检测与鉴定
核酸杂交检测法
原理：
碱基互补配对原则
过程：
③使探针和转基因生物的DNA
（或mRNA）杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中（或目的基因转录出了mRNA）
①提取转基因生物的DNA
②制作基因探针：
用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记。
抗原-抗体杂交
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若
有杂交带出现，表明目的
基因已形成蛋白质产品。
抗虫、抗病或活性鉴定
通过抗虫或抗病的接种实验。有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
获取质粒
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切
割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目
的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴
定目的基因
是否稳定维
持和表达其
遗传特性
基因工程
的基本操
作程序
1.下列关于基因的叙述中正确的是
A.基因在DNA双链上成对存在
B.基因中含有遗传密码
C.基因位于DNA分子上
D.基因由四个脱氧核糖核苷酸分子组成
C
2.有关基因工程的叙述正确的是
A.限制酶只在获得目的基因时才用
B.重组质粒的形成在细胞内完成
C.质粒都可作为运载体
D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
D
3、以下说法正确的是
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
4、不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因 D、它是环状DNA
C
D
3.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
A
4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
C
5．在受体细胞中能检测出目的基因是因为
A.目的基因上有标记
B.重组质粒能够复制
C.质粒具有某些标记基因
D.以上都不正确
C
6.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是 ( )
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
B
(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的__处，DNA连接酶作用于__处。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和_______________法。
（3）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的____________作探针进行分子杂交检测，又要用___________________方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
1、为扩大可耕地面积，
增加粮食产量，黄河三
角洲等盐碱地的开发利
用备受关注。我国科学
家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
a
a
花粉管通道法
耐盐基因
一定浓度盐水浇灌