生物人教版（2019）选择性必修3 3.1重组DNA技术的基本工具（共50张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版（2019）选择性必修3 3.1重组DNA技术的基本工具（共50张ppt） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 8.8MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-03-03 22:59:21 | ||
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文档简介
(共50张PPT)
1.基因工程的概念：
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程的别名
操作环境
操作对象
操作水平
原理
结果
DNA重组技术
生物体外
基因
DNA分子水平
人们需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
一、基因工程简介
（1）为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
（2）为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
①基因是控制生物性状的独立遗传单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
一、基因工程简介
2.基因工程实施基础
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
第3章第1节重组DNA技术的基本工具
1. 重组DNA技术三种基本工具及其作用
2. 基因工程载体需要具备的条件
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
3.基因工程的基本工具
一、基因工程简介
来源 主要来自__________
种类 约 种
特点 识别双链DNA分子的某种________________
切割特定核苷酸序列中的特定位点
作用 断裂 的两个核苷酸之间的___________
结果 产生 或平末端
原核生物
4 000
特定核苷酸序列
特定部位
磷酸二酯键
黏性末端
阅读课本第71页“分子手术刀”——限制性内切核酸酶的相关内容，填写下表
二、基因工程的基本工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1、推测限制酶存在于原核生物中的作用是 ？
原核生物的防御机制，以防止外来病原物的侵害。当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、从而保护自身。
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者修饰所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，细菌的限制酶不剪切自身，但可以防止外源DNA的入侵。
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3、了解限制酶的命名由来
二、基因工程的基本工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
作用:
识别：限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的特定核苷酸序列，最常见的为6个核苷酸。
切割：并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
问题：限制酶的识别序列有何特点？
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。限制酶的识别序列特点：二、基因工程的基本工具1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”回文序列中，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。（从DNA结构角度分析，俩条链的，识别序列和切割位点相同）思考：请写出一个8碱基的回文序列
CT TCATGAATTCCGTACCCGGGCCTAA
GAAGTACTTAAGGCATGGGCCCGGATT
EcoRⅠ限制酶酶切位点
黏性末端
GGCATGGG
AATTCCGTACCC
CTTCATG
GAAGTACTTAA
平末端
SmaⅠ限制酶酶切位点
GGGCCTAA
CCCGGATT
…TACCC
…ATGGG
限制酶切割DNA结果：
二、基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
中轴线
在G与A之间切割
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
EcoRI限制酶的作用（黏性末端）
二、基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
黏性末端
黏性末端
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoRI限制酶的作用（黏性末端）
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
中轴线
SmaI限制酶的作用（平末端）
在G与C之间切割
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
平末端 平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
SmaI限制酶的作用（平末端）
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
探究 活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
(3)要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？切割后的目的基因上有几个黏性（平）末端
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端；目的基因上有2个
1.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
提示 不能。
思考与讨论
(2)请结合右图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
提示 断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ____ EcoRⅠ___
HindⅢ___ BglⅡ ___
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
学以致用
Msp Ⅰ：
CCGG
GGCC
Mbo Ⅰ：
GATC
CTAG
Sma Ⅰ:
CCCGGG
GGGCCC
限制酶：
EcoRⅠ：
GAATTC
CTTAAG
拓展：
同尾酶：来源不同，识别不同，切割位点相同，末端相同
同裂酶：来源不同，识别相同，切割位点可同可不同，末端可同可不同
限制酶的识别序列：
（Bamh1和Mbo1）
（Bamh1和Bst1）
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但难以连接单链DNA！
磷酸二酯键
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
二、基因工程的基本工具
(1)作用：
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
(2)类型：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,使之成为一个完整的DNA分子。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
二、基因工程的基本工具
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
目的基因1
目的基因2
限制酶的选择：
一种酶：EcoRⅠ
两种酶：EcoRⅠ和 Hind Ⅲ
EcoRⅠ和 BamHⅠ
Hind Ⅲ和 BamHⅠ
同裂酶
一种酶：BamHⅠ或 BstⅠ
两种酶：Hind Ⅲ 和 BamHⅠ
Hind Ⅲ 和 BstⅠ
BamHⅠ和 BstⅠ
1.要切割目的基因，选择能够产生不同末端的酶，能够防止目的基因切除后自身环化。
3．连接结果
自身连接
自身连接
一
二
三
四
二、基因工程的基本工具
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶
同一限制酶
同一限制酶
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
2．常用载体——质粒
(1)本质：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(2)作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞,并稳定存在。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
(3)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因（改造的）
无毒害作用，容易分离
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
使目的基因稳定存在且数量可扩增
可携带多个或多种外源基因
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤；易操作
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.1 DNA重组技术的基本工具 小结
1.限制性核酸内切酶
——“分子手术刀”
2.DNA连接酶
——“分子缝合针”
3.基因进入受体细胞的载体
——“分子运输车”
工具酶
P73 思考与讨论
2.用DNA重组技术可以赋于生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E．coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中______酶切割后的DNA片段可以用E．coli DNA连接酶连接。上图中______酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DMA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________________。
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能____________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），标记基因的作用是__________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子的作用是________________________。
(3) 自我复制 限制酶切割位点 用于重组DNA的筛选和鉴定(4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段(5)农杆菌转化法
基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-．根据图示判断下列操作正确的是（ ）
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
A
酶Ⅱ
酶Ⅰ和Ⅱ
酶Ⅱ
酶Ⅰ和Ⅱ
质粒用酶Ⅰ保留一个标记基因
目的基因用酶Ⅱ才能切割下来
思考：用限制酶切割时需注意的事项？
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
1.切割目的基因时： 。
2.切割质粒时： 。
3.切割目的基因和质粒时，最好选用不同的限制酶切割
理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
(1)用上图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_________这 2 种限制酶切割酶切后的载体和目的基因片段，四环素抗性基因能作为标记基因的理由是_____。
Hind和Bcl
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
(3)若 BamH Ⅰ酶切的DNA 末端与 BclⅠ酶切的DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为______，对于该部位，这两种酶_____（填“都能”“都不能”或“只有一种能” ） 切开。(4)若用 Sau3A Ⅰ切割图 1 质粒，最多可获得_____种大小不同的DNA 片段。
都不能
7
原因？
限制酶和目的基因混在一起时，限制酶能完全切割和不完全切割。
完全切割：能切的都切
不完全切割：随机切割（切割位置和次数随机）
1.分别用一种酶完全切割以上DNA，形成几种长度的DNA？
2.同时用俩种酶完全切割，形成几种长度的DNA？
3若俩种酶不完全切割，最多形成几种长度的DNA？
4.若质粒完全切割能够得到4,6,9的片段，则不完全切割的片段？
7种
用Xhol和SaII两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段（限制酶在对应切点一定能切开），酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是（ ）
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键C．图2中②可能是用XhoI处理得到的酶切产物D．用XhoI和SalI同时处理该DNA电泳后得到7种产物
D
3．图甲表示某环状DNA分子经限制性内切核酸酶（EcoRI）完全酶切后的片段电泳结果。若改变某种条件可能获得如图乙所示的电泳结果（不考虑条带的宽度）。下列叙述错误的是（ ）
A．该DNA分子中含有4个EcoRⅠ酶切位点B．乙图可能出现5.5kb的片段
C．适当缩短反应时间，得到图乙结果的可能性越大D．电泳过程中，甲乙的上侧接电泳仪的负极
B
在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？
A．HindⅢ1个，BamHⅠ2 个
B．HindⅢ2个，BamHⅠ3个
C．HindⅢ2个，BamHⅠ1 个
D．HindⅢ和BamHⅠ各有2 个
A
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
二、实验原理：
1.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
3.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
1.选材：
2.试剂：
①研磨液:
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
三、材料用具
溶解膜结构，蛋白质变性，抑制DNA（水解）酶活性等
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
2.过滤或离心取上清液：
方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用：
四、方法步骤：
研磨洋葱
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
①搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
用冷却的酒精析出DNA
四、方法步骤：
②酒精预冷的作用：
低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
四、方法步骤：
1.二苯胺原本的颜色？反应后的颜色？两只试管形成对照。
2.溶解DNA？沸水浴加热？现配现用？
3.蓝色深浅与什么相关？
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分离。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
思考
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindI、XbaI、EcoRV和Xhol进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
二、拓展应用（P74-75）
练习与应用
提示:识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端
的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断;这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1.基因工程的概念：
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程的别名
操作环境
操作对象
操作水平
原理
结果
DNA重组技术
生物体外
基因
DNA分子水平
人们需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
一、基因工程简介
（1）为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
（2）为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
①基因是控制生物性状的独立遗传单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
一、基因工程简介
2.基因工程实施基础
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
第3章第1节重组DNA技术的基本工具
1. 重组DNA技术三种基本工具及其作用
2. 基因工程载体需要具备的条件
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
3.基因工程的基本工具
一、基因工程简介
来源 主要来自__________
种类 约 种
特点 识别双链DNA分子的某种________________
切割特定核苷酸序列中的特定位点
作用 断裂 的两个核苷酸之间的___________
结果 产生 或平末端
原核生物
4 000
特定核苷酸序列
特定部位
磷酸二酯键
黏性末端
阅读课本第71页“分子手术刀”——限制性内切核酸酶的相关内容，填写下表
二、基因工程的基本工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1、推测限制酶存在于原核生物中的作用是 ？
原核生物的防御机制，以防止外来病原物的侵害。当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、从而保护自身。
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者修饰所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，细菌的限制酶不剪切自身，但可以防止外源DNA的入侵。
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3、了解限制酶的命名由来
二、基因工程的基本工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
作用:
识别：限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的特定核苷酸序列，最常见的为6个核苷酸。
切割：并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
问题：限制酶的识别序列有何特点？
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。限制酶的识别序列特点：二、基因工程的基本工具1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”回文序列中，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。（从DNA结构角度分析，俩条链的，识别序列和切割位点相同）思考：请写出一个8碱基的回文序列
CT TCATGAATTCCGTACCCGGGCCTAA
GAAGTACTTAAGGCATGGGCCCGGATT
EcoRⅠ限制酶酶切位点
黏性末端
GGCATGGG
AATTCCGTACCC
CTTCATG
GAAGTACTTAA
平末端
SmaⅠ限制酶酶切位点
GGGCCTAA
CCCGGATT
…TACCC
…ATGGG
限制酶切割DNA结果：
二、基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
中轴线
在G与A之间切割
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
EcoRI限制酶的作用（黏性末端）
二、基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
黏性末端
黏性末端
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoRI限制酶的作用（黏性末端）
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
中轴线
SmaI限制酶的作用（平末端）
在G与C之间切割
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
平末端 平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
SmaI限制酶的作用（平末端）
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
探究 活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
(3)要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？切割后的目的基因上有几个黏性（平）末端
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端；目的基因上有2个
1.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
提示 不能。
思考与讨论
(2)请结合右图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
提示 断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ____ EcoRⅠ___
HindⅢ___ BglⅡ ___
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
学以致用
Msp Ⅰ：
CCGG
GGCC
Mbo Ⅰ：
GATC
CTAG
Sma Ⅰ:
CCCGGG
GGGCCC
限制酶：
EcoRⅠ：
GAATTC
CTTAAG
拓展：
同尾酶：来源不同，识别不同，切割位点相同，末端相同
同裂酶：来源不同，识别相同，切割位点可同可不同，末端可同可不同
限制酶的识别序列：
（Bamh1和Mbo1）
（Bamh1和Bst1）
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但难以连接单链DNA！
磷酸二酯键
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
二、基因工程的基本工具
(1)作用：
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
(2)类型：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,使之成为一个完整的DNA分子。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
二、基因工程的基本工具
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
目的基因1
目的基因2
限制酶的选择：
一种酶：EcoRⅠ
两种酶：EcoRⅠ和 Hind Ⅲ
EcoRⅠ和 BamHⅠ
Hind Ⅲ和 BamHⅠ
同裂酶
一种酶：BamHⅠ或 BstⅠ
两种酶：Hind Ⅲ 和 BamHⅠ
Hind Ⅲ 和 BstⅠ
BamHⅠ和 BstⅠ
1.要切割目的基因，选择能够产生不同末端的酶，能够防止目的基因切除后自身环化。
3．连接结果
自身连接
自身连接
一
二
三
四
二、基因工程的基本工具
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶
同一限制酶
同一限制酶
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
2．常用载体——质粒
(1)本质：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(2)作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞,并稳定存在。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
(3)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因（改造的）
无毒害作用，容易分离
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
使目的基因稳定存在且数量可扩增
可携带多个或多种外源基因
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤；易操作
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.1 DNA重组技术的基本工具 小结
1.限制性核酸内切酶
——“分子手术刀”
2.DNA连接酶
——“分子缝合针”
3.基因进入受体细胞的载体
——“分子运输车”
工具酶
P73 思考与讨论
2.用DNA重组技术可以赋于生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E．coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中______酶切割后的DNA片段可以用E．coli DNA连接酶连接。上图中______酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DMA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________________。
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能____________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），标记基因的作用是__________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子的作用是________________________。
(3) 自我复制 限制酶切割位点 用于重组DNA的筛选和鉴定(4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段(5)农杆菌转化法
基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-．根据图示判断下列操作正确的是（ ）
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
A
酶Ⅱ
酶Ⅰ和Ⅱ
酶Ⅱ
酶Ⅰ和Ⅱ
质粒用酶Ⅰ保留一个标记基因
目的基因用酶Ⅱ才能切割下来
思考：用限制酶切割时需注意的事项？
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
1.切割目的基因时： 。
2.切割质粒时： 。
3.切割目的基因和质粒时，最好选用不同的限制酶切割
理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
(1)用上图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_________这 2 种限制酶切割酶切后的载体和目的基因片段，四环素抗性基因能作为标记基因的理由是_____。
Hind和Bcl
8．下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。
(3)若 BamH Ⅰ酶切的DNA 末端与 BclⅠ酶切的DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为______，对于该部位，这两种酶_____（填“都能”“都不能”或“只有一种能” ） 切开。(4)若用 Sau3A Ⅰ切割图 1 质粒，最多可获得_____种大小不同的DNA 片段。
都不能
7
原因？
限制酶和目的基因混在一起时，限制酶能完全切割和不完全切割。
完全切割：能切的都切
不完全切割：随机切割（切割位置和次数随机）
1.分别用一种酶完全切割以上DNA，形成几种长度的DNA？
2.同时用俩种酶完全切割，形成几种长度的DNA？
3若俩种酶不完全切割，最多形成几种长度的DNA？
4.若质粒完全切割能够得到4,6,9的片段，则不完全切割的片段？
7种
用Xhol和SaII两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段（限制酶在对应切点一定能切开），酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是（ ）
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键C．图2中②可能是用XhoI处理得到的酶切产物D．用XhoI和SalI同时处理该DNA电泳后得到7种产物
D
3．图甲表示某环状DNA分子经限制性内切核酸酶（EcoRI）完全酶切后的片段电泳结果。若改变某种条件可能获得如图乙所示的电泳结果（不考虑条带的宽度）。下列叙述错误的是（ ）
A．该DNA分子中含有4个EcoRⅠ酶切位点B．乙图可能出现5.5kb的片段
C．适当缩短反应时间，得到图乙结果的可能性越大D．电泳过程中，甲乙的上侧接电泳仪的负极
B
在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？
A．HindⅢ1个，BamHⅠ2 个
B．HindⅢ2个，BamHⅠ3个
C．HindⅢ2个，BamHⅠ1 个
D．HindⅢ和BamHⅠ各有2 个
A
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
二、实验原理：
1.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
3.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
1.选材：
2.试剂：
①研磨液:
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
三、材料用具
溶解膜结构，蛋白质变性，抑制DNA（水解）酶活性等
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
2.过滤或离心取上清液：
方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用：
四、方法步骤：
研磨洋葱
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
①搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
用冷却的酒精析出DNA
四、方法步骤：
②酒精预冷的作用：
低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
四、方法步骤：
1.二苯胺原本的颜色？反应后的颜色？两只试管形成对照。
2.溶解DNA？沸水浴加热？现配现用？
3.蓝色深浅与什么相关？
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分离。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
思考
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindI、XbaI、EcoRV和Xhol进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
二、拓展应用（P74-75）
练习与应用
提示:识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端
的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断;这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。